Denne protokollen definerer en ny metode for å opprette en romlig detaljert endelig element modell av intracellulær arkitektur cardiomyocytes fra elektronmikroskop og AC confocal mikroskopi bilder. Kraften i dette romlig detaljert modell er demonstrert ved hjelp av case-studier i kalsium signalisering og Bioenergi.
Med ankomsten av tredimensjonale (3D) bildeteknologi som elektron tomografi, seriell-blokk-ansikt skanning elektronmikroskop og AC confocal mikroskopi, det vitenskapelige samfunnet har tilgang til store datasett på sub mikrometer oppløsning som karakteriserer arkitektoniske remodeling som følger endringer i cardiomyocyte-funksjonen i helse og sykdom. Men er disse datasett under-utnyttet for å undersøke rollen av mobilnettet arkitektur remodeling i cardiomyocyte-funksjonen. Formålet med denne protokollen er å skissere hvordan å lage en nøyaktig endelig element modell av en cardiomyocyte med høy oppløsning elektronmikroskop og AC confocal mikroskopi bilder. En detaljert og nøyaktig modell av mobilnettet arkitektur har betydelig potensial for å gi ny innsikt i cardiomyocyte biologi, mer enn eksperimenter alene kan garner. Kraften i denne metoden ligger i dens evne til beregningsmessig sikring informasjon fra to ulike tenkelig modaliteter av cardiomyocyte ultrastructure å utvikle en enhetlig og detaljert modell av cardiomyocyte. Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å integrere elektron tomografi og AC confocal mikroskopi bilder av voksne mannlige Wistar (navn etter en bestemt hunderase albino rotten) rotte cardiomyocytes å utvikle en halv-sarcomere endelig element modell av cardiomyocyte. Fremgangsmåten genererer en 3D endelig element modell som inneholder en nøyaktig, høyoppløselige skildring (på ~ 35 nm) av fordelingen av mitokondrier, myofibrils og ryanodine reseptor klynger som frigjør nødvendig kalsium for cardiomyocyte sammentrekning fra sarcoplasmic reticular nettverket (SR) i myofibril og cytosolic kupé. Modellen generert her som en illustrasjon ikke innlemme tverrstilt-tubule arkitekturen eller sarcoplasmic reticular nettverket og er derfor en minimal modell av cardiomyocyte. Likevel kan modellen som allerede brukes i simulering-baserte undersøkelser i rollen av cellestruktur i kalsium signal og mitokondrie bioenergi, som er illustrert og diskutert bruker to kasusstudier presenteres etter det detaljert protokollen.
Eksitasjon-sammentrekning kopling (ECC) i hjertet refererer til viktige og intrikat kobling mellom elektrisk magnetisering av cardiomyocyte membranen og påfølgende mekanisk sammentrekning av cellen under hvert hjerteslag. Matematiske modeller har spilt en nøkkelrolle i å utvikle en kvantitative forståelse av sammenkoblede biokjemiske prosesser som regulerer handling potensial1, cytosolic kalsium signalering2, bioenergi3, og påfølgende kontraktile styrkegenerering. Slike modeller har også vellykket forutsagte endringer i hjerterytme når én eller flere av disse biokjemiske prosesser gjennomgå endringer4,5. Den svært organisert ultrastructure av cardiomyocyte har stadig blitt anerkjent å spille en avgjørende rolle i normal kontraktile funksjon av cellen og hele hjerte. Faktisk forekomme endringer i morfologi og organisering av komponenter i cardiac ultrastructure parallelt biokjemiske endringer i sykdom forhold som hypertrofi6, hjertesvikt7og diabetiker kardiomyopati8. Om disse strukturelle endringer er mindre, adaptive eller patologisk svar til endring biokjemiske forhold er fortsatt hovedsakelig ukjent9. Den iboende tett koplingen mellom form og funksjon i biologi betyr at eksperimentelle studier alene ikke kan gi dypere innsikt enn sammenhenger mellom strukturelle remodeling og cardiomyocyte funksjon. En ny generasjon av matematiske modeller som kan innlemme strukturelle montering av sub mobilnettet komponentene sammen med godt studert biokjemiske prosesser, er nødvendig for å utvikle en omfattende, kvantitative forståelse av forholdet mellom struktur, biokjemi og contractile kraften i cardiomyocytes. Denne protokollen beskriver metoder som kan brukes til å generere strukturelt nøyaktig endelig element modeller av cardiomyocytes som kan brukes til slike undersøkelser.
Det siste tiåret har sett betydelige fremskritt i 3D elektronmikroskop10, AC confocal11og super-oppløsning mikroskopi12 som gir enestående, høyoppløselige innsikt i nano-skala og mikro-skala montering av den sub cellulære komponenter av cardiomyocyte. Nylig har disse datasett blitt brukt til å generere datamodeller cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. Disse modellene bruke en veletablert engineering simulering metoden, kalles de endelige element metoden17, opprette endelig element beregningsorientert maskene over hvilke biokjemiske prosesser og cardiomyocyte sammentrekninger kan simuleres. Men er disse modellene begrenset av oppløsning og detaljer som mikroskopi metode kan tilby i et bilde datasett. For eksempel elektronmikroskop kan generere nanometer-nivå detalj cellestruktur, men det er vanskelig å identifisere spesifikke proteiner i bildet som ville være nødvendig å opprette en modell. På den annen side, optisk super-oppløsning mikroskopi gir høy kontrast bilder med en oppløsning på 50 nm i bare en velge noen molekylær komponenter i cellen. Bare ved å integrere utfyllende informasjon fra disse tenkelig modaliteter kan en realistisk utforske følsomheten til funksjonen endringer i strukturen. Correlative lys og elektronmikroskop er fortsatt ikke en rutinemessig prosedyre og det vil fortsatt lide begrensningen at kun et begrenset antall komponenter kan være farget i visningen immunofluorescence og korrelert med visningen elektronmikroskop.
Denne protokollen presenterer en ny tilnærming18 som statistiske metoder19 til å analysere og beregningsmessig sikring * lys informasjon på den romlige fordelingen av ion-kanaler med elektronmikroskop informasjon på andre hjerte Ultrastructure komponenter, for eksempel myofibrils og mitokondrier. Dette gir en endelig element modell som kan brukes med Biofysiske modeller av biokjemiske prosesser for å studere rollen til cardiomyocyte sub mobilnettet organisasjon biokjemiske prosesser som regulerer cardiomyocyte sammentrekning. For eksempel denne protokollen kan brukes til å lage modeller fra sunn og streptozotocin-indusert diabetiker cardiac myocytter å studere effekten av strukturelle Boligmodernisering på cardiac celle-funksjonen som er observert i diabetiker dyr modeller8. En ekstra fordel av statistiske natur presentert metoden er også illustrert i protokollen: metoden kan generere flere forekomster av finite element geometrier som nærmere etterligner eksperimentelt observert variasjoner i cellestrukturen.
Som en oversikt, punktene protokollen inkludere: (i) utarbeidelse av hjerte vev for elektronmikroskop å generere 3D-bilder med tilstrekkelig oppløsning og kontrast; (ii) rekonstruksjon og segmentering av 3D bildestakker fra elektronmikroskop data ved hjelp av en 3D elektronmikroskop gjenoppbygging og bildeanalyse programvare kalt IMOD20; (iii) bruke iso2mesh21 til å generere et endelig element nett bruker segmenterte data som inndata; (iv) bruker romanen algoritme og koder for å kartlegge fordelingen av ionekanaler på endelig element mesh.
Forutsetningen av tilnærming til hvert trinn er beskrevet i protokollen, og representant resultatene er gitt i de tilhørende figurene. En oversikt markeres angir hvor de genererte romlig detaljerte modellene kan brukes til å studere romlige dynamikken i kalsium ECC, samt mitokondrie bioenergi. Noen av de nåværende begrensningene av protokollen er diskutert, samt nye utbygginger som er underveis for å overvinne dem og videre før en kvantitative forståelse av rollen cellestrukturen til hjerte systemer biologi. Hvordan disse metodene kan generaliseres åopprette endelig element modeller av andre celletyper er også adressert.
Brukere av denne protokollen kan hoppe over trinn 1 og gjenoppbygging del av trinn 2 hvis de har tilgang til en eksisterende elektronmikroskop bildestakk. Brukere som har til hensikt å skaffe data i samarbeid med erfarne elektron microscopists ønsker å diskutere og sammenligne fiksering og flekker prosedyrer i trinn 1 med expert å bestemme en optimal protokoll for oppkjøpet.
Over protokollen beskriver viktige trinn for å generere en roman endelig element geometriske modell av cardiomyocyte ultrastructure. Metoden gjør det mulig for beregningsorientert blanding av forskjellige mikroskopi (eller, i prinsippet andre data) modaliteter å utvikle en mer omfattende beregningsorientert modellen cardiomyocyte dynamics som inneholder informasjon om romlige celle arkitektur. Det er for øyeblikket ingen andre protokoll til å opprette slik modell av en cardiomyocyte.
Trin…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Royal Society av New Zealand Marsden raskt starte Grant 11-UOA-184, menneskelige grenser forskning Program grant RGP0027/2013 og australske Research Council Discovery Project Grant DP170101358.
Materials | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
Equipment | |||
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
Retort stand | Proscitech | T752 | |
Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
Software | |||
SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
spatstat | R-project | install via R program | |
rgl | R-project | install via R program | |
doparallel | R-project | install via R program | |
foreach | R-project | install via R program | |
doSNOW | R-project | install via R program | |
iterators | R-project | install via R program |