Criando um modelo geométrico de elementos finitos estruturalmente realista de um casos para estudar o papel da arquitetura celular em casos de biologia de sistemas
Summary
Este protocolo descreve um método novo para criar um modelo de elementos finitos espacialmente detalhada da arquitetura intracelular do cardiomyocytes de imagens de microscopia confocal e microscopia eletrônica. O poder deste modelo espacialmente detalhada é demonstrado usando estudos de caso em sinalização de cálcio e Bioenergética.
Abstract
Com o advento das tecnologias de imagem tridimensionais (3D) como a tomografia computadorizada do elétron, serial-bloco-rosto varredura, microscopia eletrônica e microscopia confocal, a comunidade científica tem acesso sem precedentes aos grandes conjuntos de dados no sub-micrônicas resolução que caracterizam a remodelação arquitectónica que acompanha as alterações em função de casos na saúde e na doença. No entanto, esses conjuntos de dados tem sido subutilizado para investigar o papel da arquitetura celular remodelação em função de casos. O propósito do presente protocolo é delinear como criar um modelo de elementos finitos precisos de um casos usando imagens de microscopia confocal e microscopia eletrônica de alta resolução. Um modelo detalhado e preciso de arquitetura celular tem um potencial significativo para fornecer novos insights sobre biologia de casos, mais do que podem reunir experiências sozinhos. O poder deste método reside na sua capacidade de fundir computacionalmente informações de duas modalidades de imagens díspares da ultraestrutura de casos para desenvolver um modelo unificado e detalhado dos casos. Este protocolo descreve etapas para integrar o tomography do elétron e imagens de microscopia confocal de cardiomyocytes masculino adulto do rato Wistar (nome de uma raça específica de rato albino) para desenvolver um modelo de elementos finitos de metade-sarcômero dos casos. O procedimento gera um modelo de elementos finitos 3D que contém uma representação exata, de alta resolução (da ordem de ~ 35 nm) da distribuição das mitocôndrias, miofibrilas e clusters de receptor de ryanodine que liberam o cálcio necessário para casos contração da rede reticular sarcoplasmic (SR) no compartimento citosólico e Miofibrilha. O modelo gerado aqui como uma ilustração não incorporar detalhes da arquitetura do túbulo transverso- ou a rede reticular sarcoplasmic e, portanto, é um modelo mínimo dos casos. No entanto, o modelo já pode ser aplicado em investigações baseada em simulações sobre o papel da estrutura celular em bioenergética mitocondrial e sinalização cálcio, que é ilustrada e discutido usando dois estudos de caso apresentados a seguir o Protocolo detalhado.
Introduction
Acoplamento excitação-contração (ECC) no coração refere-se a importante e intrincada de acoplamento entre a excitação elétrica da membrana casos e a subsequente contração mecânica da célula durante cada batimento cardíaco. Modelos matemáticos têm desempenhado um papel chave no desenvolvimento de uma compreensão quantitativa dos processos bioquímicos interligados que regulam o potencial de ação1, cálcio citosólico sinalização2, bioenergética,3e subsequente geração de força contrátil. Tais modelos previram também com êxito as alterações para o batimento cardíaco quando um ou vários destes processos bioquímicos sofrem alterações4,5. A ultraestrutura altamente organizado dos casos cada vez mais tem sido reconhecida a desempenhar um papel crítico na função contrátil normal da célula e de todo o coração. Com efeito, alterações da morfologia e organização dos componentes da ultraestrutura cardíaca ocorrem em paralelo com as alterações bioquímicas em condições de doença como hipertrofia6, insuficiência cardíaca7e cardiomiopatia diabética8. Se essas mudanças estruturais são menores, adaptáveis ou patológicas respostas à mudança da condições bioquímicas ainda é em grande parte desconhecido9. O acoplamento inerentemente apertado entre forma e função em biologia significa que estudos experimentais sozinhos não podem fornecer percepções mais profundas do que as correlações entre remodelação estrutural e função de casos. Uma nova geração de modelos matemáticos que pode incorporar a montagem estrutural dos componentes sub celulares, juntamente com os processos bioquímicos bem estudados, são necessários para desenvolver uma compreensão abrangente da relação quantitativa entre estrutura, bioquímica e força contrátil em cardiomyocytes. Este protocolo descreve métodos que podem ser usados para gerar modelos de elementos finitos estruturalmente precisos dos cardiomyocytes que pode ser usado para tais investigações.
A última década viu avanços significativos em microscopia 3D10confocal11e de microscopia de super-resolução12 que fornecem insights sem precedentes, de alta resolução em Assembleia nano-escala e micro escala do componentes sub celulares dos casos. Recentemente, esses conjuntos de dados têm sido utilizados para gerar modelos computacionais de casos ultraestrutura13,14,15,16. Estes modelos de usam um método de simulação engenharia bem estabelecida, chamado o método de elementos finitos17, para criar elementos finitos malhas computacionais sobre quais processos bioquímicos e casos contrações podem ser simuladas. No entanto, estes modelos são limitados pela resolução e detalhe que um método de microscopia pode fornecer um conjunto de dados de imagem. Por exemplo, microscopia eletrônica pode gerar nanômetros-nível detalhe de estrutura celular, mas é difícil identificar proteínas específicas dentro da imagem do que seria necessário para criar um modelo. Por outro lado, a microscopia óptica de super-resolução pode fornecer imagens de alto contraste em resoluções da ordem de 50 nm de somente um seleto poucos molecular componentes da célula. Somente integrando informações complementares a partir dessas modalidades de imagem um pode realisticamente explorar a sensibilidade da função de mudanças na estrutura. Correlativo luz e microscopia eletrônica ainda, não é um procedimento de rotina, e ele ainda iria sofrer a limitação que apenas um número limitado de componentes pode ser manchado na exibição de imunofluorescência e correlacionado com a exibição de microscopia eletrônica.
Este protocolo apresenta uma nova abordagem18 que usa métodos estatísticos19 para analisar e computacionalmente fusível fotomicroscopia informações sobre a distribuição espacial dos canais iônicos com microscopia eletrônica informações sobre outro cardíaco componentes de ultraestrutura, como miofibrilas e mitocôndrias. Isso produz um modelo de elementos finitos que pode ser usado com modelos biofísicos de processos bioquímicos para estudar o papel da organização sub celular de casos sobre os processos bioquímicos que regulam a contração de casos. Por exemplo, este protocolo pode ser usado para criar modelos de saudável e induzido por estreptozotocina diabéticos miócitos para estudar o efeito da remodelação estrutural em função de célula cardíaca que é observada em animais diabéticos modelos8. Uma vantagem adicional da natureza estatística do método apresentado também é ilustrada no protocolo: o método pode gerar várias instâncias de geometrias de elementos finitos que imitam de perto as variações observadas experimentalmente na estrutura celular.
Como uma visão geral, as etapas do protocolo incluem: (i) preparação do tecido cardíaco por microscopia eletrônica de varredura gerar imagens 3D com suficiente resolução e contraste; (ii) reconstrução e segmentação de pilhas 3D imagem de microscopia eletrônica de dados usando uma reconstrução 3D de microscopia eletrônica e software de análise de imagem chamaram IMOD20; (iii) usando iso2mesh21 para gerar uma malha de elementos finitos usando os dados segmentados como entrada; (iv) usando o algoritmo de romance e códigos para mapear a distribuição de canais de íon para a malha de elementos finitos.
A premissa da abordagem de cada passo é descrita dentro do protocolo, e resultados representativos são fornecidos nas figuras que acompanha. Uma visão geral é descrita especificando como os modelos espacialmente detalhados gerados podem ser usados para estudar a dinâmica espacial de cálcio durante o ECC, bem como a bioenergética mitocondrial. Algumas das limitações atuais do protocolo são discutidas, bem como novos desenvolvimentos que estão em andamento para superá-los e avançar ainda mais uma compreensão quantitativa do papel da estrutura celular para a biologia de sistemas cardíaco. Como esses métodos podem ser generalizados para criar modelos de elementos finitos de outros tipos de célula também é abordado.
Usuários do presente protocolo podem ignorar a etapa 1 e a parte da reconstrução da etapa 2 se eles têm acesso a uma pilha de imagem de microscopia eletrônica pre-existente. Usuários que pretendem adquirir seus dados em colaboração com os mais experientes microscopistas elétron podem desejar discutir e comparar a fixação e coloração procedimentos na etapa 1, com o perito para determinar um protocolo ideal para aquisição.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descreve etapas chaves para gerar um modelo geométrico de romance de elementos finitos de casos ultraestrutura. O método permite que as modalidades de fusão computacional de microscopia diferente (ou, em princípio, outros dados) desenvolver um modelo computacional mais abrangente da dinâmica de casos que inclui detalhes da arquitetura espacial cell. Não há atualmente nenhum outro protocolo disponível para criar um modelo de um casos.
Etapa 1 descreve um protocolo para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Royal Society de Nova Zelândia Marsden rápido começar Grant 11-UOA-184, a concessão de pesquisa de programa de ciência humana fronteiras RGP0027/2013 e o australiano pesquisa Conselho Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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