Creando un modelo geométrico realista estructural de elementos finitos de cardiomiocitos para estudiar el papel de la arquitectura celular de cardiomiocitos biología de sistemas
Summary
Este protocolo describe un método novedoso para crear un modelo de elementos finitos espacial detallada de la arquitectura intracelular de cardiomiocitos de imágenes de microscopía confocal y microscopia electrónica. La potencia de este modelo espacial detallada se demuestra mediante estudios de caso en la señalización de calcio y bioenergética.
Abstract
Con la llegada de tres dimensiones (3D) tecnologías imagenológicas como la tomografía de electrones, cara de serie bloque de análisis de microscopía electrónica y microscopía confocal, la comunidad científica tiene acceso sin precedentes a grandes conjuntos de datos en secundario-micrómetro resolución que caracterizan la remodelación arquitectónica acompaña a cambios en la función de cardiomiocitos en salud y enfermedad. Sin embargo, estos conjuntos de datos han sido utilizados para investigar el papel de la arquitectura celular remodelación en función de los cardiomiocitos. El propósito de este protocolo es describir cómo crear un modelo de elementos finitos precisa de un cardiomiocito mediante microscopia electrónica de alta resolución e imágenes de microscopía confocal. Un modelo detallado y preciso de la arquitectura celular tiene gran potencial para proporcionar nuevas penetraciones en la biología de cardiomiocitos, más experimentos solo pueden reunir. El poder de este método radica en su capacidad de cómputo fusionar información de dos modalidades de imágenes dispares de ultraestructura de cardiomiocitos para desarrollar un modelo unificado y detallado de los cardiomiocitos. Este protocolo describe los pasos para integrar la tomografía electrónica e imágenes de microscopía confocal de cardiomiocitos de rata Wistar (nombre de una raza específica de rata albina) macho adulto para desarrollar un modelo de elementos finitos medio sarcómero de los cardiomiocitos. El procedimiento genera un modelo de elementos finitos 3D que contiene una descripción exacta, alta resolución (orden del día de ~ 35 nm) de la distribución de las mitocondrias, miofibrillas y los grupos de receptores de rianodina que liberan el calcio necesario para el cardiomiocito contracción de la red reticular sarcoplásmica (SR) en el compartimiento cytosolic y miofibrillas. El modelo generado aquí una ilustración no incorpora detalles de la arquitectura del túbulo transversal o la sarcoplásmica, reticular, red y por lo tanto es un modelo mínimo de los cardiomiocitos. Sin embargo, el modelo ya puede ser aplicado en investigaciones basadas en simulación en el papel de la estructura de la célula en bioenergética mitocondrial y señalización calcio, que es ilustrado y discutido usando dos estudios de caso que se presentan después de la Protocolo detallado.
Introduction
Acoplamiento excitación-contracción (ECC) en el corazón se refiere a la importante e intrincado acoplamiento entre la excitación eléctrica de la membrana del cardiomiocito y la posterior contracción mecánica de la célula durante cada latido. Modelos matemáticos han desempeñado un papel clave en el desarrollo de una comprensión cuantitativa de los procesos bioquímicos vinculados entre sí que regulan el potencial de acción1,2,3de bioenergética, de señalización de calcio citosólico y la posterior generación de la fuerza contráctil. Tales modelos han predicho con éxito los cambios en el latido del corazón cuando uno o varios de estos procesos bioquímicos se someten a alteraciones4,5. La ultraestructura altamente organizada de los cardiomiocitos se ha reconocido cada vez más a desempeñar un papel crítico en la función contráctil normal de la célula y el corazón entero. De hecho, cambios en la morfología y organización de los componentes de la ultraestructura cardiaca se producen en paralelo a los cambios bioquímicos en condiciones de enfermedad tales como hipertrofia6,7de insuficiencia cardíaca y miocardiopatía diabética8. Si estos cambios estructurales son menores, adaptativas o patológicas las respuestas a las cambiantes condiciones bioquímicas sigue siendo en gran parte desconocido9. El acoplamiento inherentemente estrecha entre forma y función en biología significa que estudios experimentales solo no pueden proporcionar penetraciones más profundas que las correlaciones entre la función de cardiomiocitos y remodelación estructural. Una nueva generación de modelos matemáticos que pueden incorporar el montaje estructural de los componentes del celulares, junto con los procesos bioquímicos estudiados, son necesarias para desarrollar una comprensión integral, cuantitativa de la relación entre la estructura, bioquímica y fuerza contráctil en los cardiomiocitos. Este protocolo describe métodos que pueden utilizarse para generar modelos de elementos finitos estructural precisa de cardiomiocitos que pueden ser utilizado para tales investigaciones.
La última década ha visto avances en microscopia electrónica 3D10, confocal11y súper resolución microscopia12 que proporcionar penetraciones sin precedentes, de alta resolución en la Asamblea de la nano-escala y microempresas de la componentes subcelular de los cardiomiocitos. Recientemente, estos conjuntos de datos se han utilizado para generar modelos computacionales de cardiomiocitos ultraestructura13,14,15,16. Estos modelos utilizan un método bien establecido de simulación ingeniería, llamado el método de elementos finitos17, para crear elementos finitos mallas computacionales sobre que procesos bioquímicos y cardiomiocitos pueden simular las contracciones. Sin embargo, estos modelos están limitados por la resolución y el detalle que puede proporcionar un método de microscopia en un conjunto de datos de imagen. Por ejemplo, la microscopia electrónica puede generar nanómetro-nivel detalle de estructura de la célula, pero es difícil identificar proteínas específicas dentro de la imagen que sería necesario crear un modelo. Por otro lado, el microscopio óptico de superresolución puede proporcionar imágenes de alto contraste con resoluciones del orden de 50 nm de sólo un selecto pocos molecular componentes de la célula. Sólo mediante la integración de información complementaria de estas modalidades de imágenes puede uno realista explorar la sensibilidad de la función a los cambios en la estructura. Correlativa luz y microscopia electrónica todavía no es un procedimiento de rutina y aún sufriría la limitación de que sólo un número limitado de componentes podría manchado en la vista de inmunofluorescencia y correlacionado con el punto de vista de la microscopia electrónica.
Este protocolo presenta un enfoque novedoso18 que usa métodos estadísticos19 para analizar y cómputo fusionar información de microscopía de luz en la distribución espacial de los canales iónicos con microscopia electrónica información en otros cardiaca componentes de la ultraestructura, como las miofibrillas y mitocondrias. Esto produce un modelo de elementos finitos que se puede utilizar con modelos biofísicos de los procesos bioquímicos para estudiar el papel de la organización celular de cardiomiocitos en los procesos bioquímicos que regulan la contracción de cardiomiocitos. Por ejemplo, este protocolo podría ser utilizado para crear modelos de salud y8modelos de miocitos cardiacos diabetes inducida para estudiar el efecto de remodelación estructural en función de la célula cardíaca que se observa en animales diabéticos. Una ventaja adicional de la naturaleza estadística del método presentado se ilustra también en el protocolo: el método puede generar varias instancias de geometrías de elementos finitos que mímico de cerca las variaciones observadas experimentalmente en la estructura de la célula.
Como un resumen, los pasos del protocolo incluyen: (i) preparación de tejido cardíaco para microscopia electrónica para generar imágenes 3D con suficiente resolución y contraste; (ii) reconstrucción y segmentación de las pilas de imágenes en 3D de datos de microscopia electrónica usando una reconstrucción 3D de microscopia electrónica y software de análisis de imagen llaman IMOD20; (iii) utilizar iso2mesh21 para generar una malla de elementos finitos usando los datos segmentados como entrada; (iv) utilizando el algoritmo de novela y códigos para la distribución de los canales iónicos en la malla de elementos finitos.
La premisa del enfoque a cada paso se describe en el protocolo y resultados representativos se encuentran en las figuras que lo acompaña. Un resumen se describe especificando cómo los modelos espacial detallados generados se pueden utilizar para estudiar la dinámica espacial de calcio durante la ECC como bioenergética mitocondrial. Algunas de las limitaciones actuales del Protocolo se discuten, así como nuevos desarrollos que se están realizando para superarlas y avanzar a una comprensión cuantitativa de la función de la estructura de la célula a la biología de sistemas cardiaco. También se aborda cómo estos métodos se podrían generalizar para crear modelos de elementos finitos de otros tipos de células.
Los usuarios de este protocolo pueden omitir paso 1 y la parte de la reconstrucción del paso 2 si tienen acceso a un montón de imagen de microscopia electrónica existente. Usuarios que deseen adquirir sus datos en colaboración con microscopistas electrón más experimentados deseen discutir y comparar la fijación y los procedimientos de tinción en el paso 1 con el experto para determinar un protocolo óptimo para la adquisición.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anterior esboza pasos clave para generar un modelo geométrico de la novela elementos finitos de ultraestructura de cardiomiocitos. El método permite modalidades de fusión computacional de microscopía diferentes (o, en principio, otros datos) desarrollar un modelo computacional más comprensivo de la dinámica de cardiomiocitos que incluye detalles de la arquitectura espacial de la célula. No hay actualmente ningún otro protocolo disponible para crear un modelo de un cardiomiocito.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Real Sociedad de Nueva Zelanda Marsden rápido inicio beca 11-solución-184, la beca de investigación de programa de ciencia de fronteras humana RGP0027/2013 y el australiano investigación Consejo descubrimiento proyecto Grant DP170101358.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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