Erstellen eines strukturell realistische Finite-Elemente geometrischen Modells von einer Cardiomyocyte zur Untersuchung der Rolle von zellulären Architektur in Cardiomyocyte Systembiologie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode um ein räumlich detaillierte finite-Elemente-Modell der intrazellulären Architektur der Herzzellen von Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bilder zu erstellen. Die Kraft dieses räumlich detaillierte Modell zeigt anhand von Fallbeispielen in Kalzium Signal- und Bioenergetik.
Abstract
Mit dem Aufkommen der dreidimensionalen (3D) imaging-Technologien wie die Elektronenstrahl-Tomographie hat Serien-Block-Face scanning Electron Microscopy und konfokale Mikroskopie, die wissenschaftliche Gemeinschaft beispiellosen Zugang zu großen Datenmengen bei Sub-Mikrometer Auflösung, die charakterisieren die architektonische Umgestaltung begleitet Veränderungen in der Cardiomyocyte Funktion in Gesundheit und Krankheit. Allerdings wurden diese Datasets für die Untersuchung der Rolle der zellulären Architektur Umbau in Cardiomyocyte Funktion genutzt. Dieses Protokoll dient, wie erstelle ich eine genaue finite-Elemente-Modell der eine Cardiomyocyte mit hochauflösende Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bildern zu skizzieren. Eine detaillierte und genaue Modell der zellulären Architektur hat erhebliches Potenzial zur erlauben neue Einblicke in Cardiomyocyte Biologie, mehr als Experimente allein sammeln können. Die Kraft dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, Informationen aus zwei unterschiedlichen bildgebender Verfahren der Cardiomyocyte Ultrastruktur, eine einheitliche und detaillierte Modell von der Cardiomyocyte zu entwickeln rechnerisch zu verschmelzen. Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Integration von Elektron Tomographie und konfokalen Mikroskopie Bilder von erwachsenen männlichen Wistar (Name für eine bestimmte Rasse Albino Ratte) Ratte Kardiomyozyten, ein halb-sarkomers finite-Elemente-Modell von der Cardiomyocyte zu entwickeln. Das Verfahren erzeugt eine 3D finite-Elemente-Modell, das eine präzise, hochauflösende Darstellung enthält (in der Größenordnung von ~ 35 nm) der Verteilung der Myofibrillen und Mitochondrien und Ryanodin-Rezeptor-Cluster, die das notwendige Kalzium für Cardiomyocyte freigeben Kontraktion von sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk (SR) in die Myofibril und cytosolischen Fach. Das Modell erzeugt hier wie eine Illustration nicht Details der quer-Röhrchen-Architektur oder die sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk zu übernehmen und daher ein minimaler Modell von der Cardiomyocyte ist. Dennoch kann das Modell bereits im Simulations-basierte Untersuchungen über die Rolle der Zellstruktur in Kalzium Signalisierung und mitochondriale Bioenergetik, wird dargestellt und diskutiert anhand von zwei Fallbeispielen, die präsentiert werden nach angewendet werden die ausführliches Protokoll.
Introduction
Erregung-Kontraktion Kupplung (ECC) im Herzen bezieht sich auf das wichtige und komplizierte Kopplung zwischen elektrischen Erregung der Cardiomyocyte Membran und die anschließende mechanische Kontraktion der Zelle bei jedem Herzschlag. Mathematische Modelle spielten eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung eines quantitativen Verständnis der vernetzten biochemischen Prozesse, die Regeln des Aktionspotentials1, zytosolischen Kalzium Signalisierung2, Bioenergetik3, und die anschließende Kontraktionskraft Generation. Solche Modelle haben auch erfolgreich vorausgesagt Änderungen an den Herzschlag bei einer oder mehrere dieser biochemischen Prozesse unterliegen Änderungen4,5. Die hoch organisiert Ultrastruktur von der Cardiomyocyte hat zunehmend erkannt worden, eine entscheidende Rolle in der normalen KONTRAKTILE Funktion der Zelle und das ganze Herz. In der Tat treten Änderungen der Morphologie und Organisation von Komponenten der kardialen Ultrastruktur parallel zu biochemischen Veränderungen bei Erkrankungen wie z. B. Hypertrophie6, Herzinsuffizienz7und Diabetische Kardiomyopathie8. Ob diese strukturellen Veränderungen sind leicht, adaptive oder pathologischen Reaktionen an die veränderten biochemische Bedingungen ist noch weitgehend unbekannt9. Die von Natur aus enge Kopplung zwischen Form und Funktion in der Biologie bedeutet, dass experimentelle Studien allein können nicht tiefere Einblicke als Korrelationen zwischen strukturellen Umgestaltung und Cardiomyocyte Funktion. Eine neue Generation von mathematischen Modellen, die die strukturelle Montage der subzellulären Komponenten, zusammen mit der gut untersuchten biochemischen Prozesse integrieren können sind notwendig, um eine umfassende, quantitativen Verständnis der Beziehung entwickeln zwischen Struktur, Biochemie und Kontraktionskraft in Herzmuskelzellen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die verwendet werden können, strukturell genau finite Elemente Modelle von Kardiomyozyten zu generieren, die für solche Untersuchungen verwendet werden kann.
Der letzte zehn Jahren erhebliche Fortschritte in der 3D-Elektronen-Mikroskopie10, konfokale11und Super-Auflösung Mikroskopie12 , die noch nie da gewesenen, hochauflösende Einblicke in die Nano-Maßstab und Mikromaßstab Montage der gesehen hat die subzelluläre Komponenten von der Cardiomyocyte. Vor kurzem wurden diese Datasets zur erzeugt Rechenmodelle Cardiomyocyte Ultrastruktur13,14,15,16. Diese Modelle verwenden eine gut etablierte engineering Simulationsmethode mit dem Namen der finite-Elemente-Methode17, finite-Elemente rechnerische Netze erstellen über die biochemischen Prozesse, die und Cardiomyocyte Kontraktionen simuliert werden können. Allerdings sind diese Modelle begrenzt durch die Auflösung und Details, die eine Methode der Mikroskopie in einem Bild-Dataset bereitstellen kann. Z. B. Elektronenmikroskopie Nanometer-Detailgenauigkeit der Zellstruktur erzeugen können, aber es ist schwierig, spezifische Proteine innerhalb des Bildes zu identifizieren, das Erstellen eines Modells notwendig wäre. Auf der anderen Seite bieten Höchstauflösung Lichtmikroskop kontrastreiche Bilder mit Auflösungen in der Größenordnung von 50 nm von nur ein paar molekularen Komponenten auswählen der Zelle. Nur durch die Integration von ergänzenden Informationen aus diesen bildgebenden Verfahren kann man die Empfindlichkeit der Funktion realistisch zu Veränderungen in der Struktur erkunden. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ist noch kein Routineeingriff und es würde immer noch die Einschränkung, dass nur eine begrenzte Anzahl von Komponenten kann in der Immunfluoreszenz-Ansicht gebeizt und mit der Elektronenmikroskopie Ansicht korreliert leiden.
Dieses Protokoll stellt einen neuartigen Ansatz18 , die verwendet statistische Methoden19 zu analysieren und rechnerisch Sicherung Lichtmikroskopie Informationen über die räumliche Verteilung von Ionenkanälen Elektronenmikroskopie-Informationen über andere Herz- Ultrastruktur Komponenten, wie z. B. Myofibrillen und Mitochondrien. Dadurch entsteht ein finite-Elemente-Modell, das mit biophysikalischen Modelle von biochemischen Prozessen verwendet werden kann, zur Untersuchung der Rolle von Cardiomyocyte subzellulären Organisation auf die biochemischen Prozesse, die Cardiomyocyte Kontraktion zu regulieren. Zum Beispiel dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Modelle aus gesunden erstellen und Streptozocin-induzierte Diabetische kardialen Myozyten untersuchen die Auswirkungen der strukturellen Umgestaltung auf Herzmuskelzellen-Funktion, die in diabetischen Tier beobachtet wird Modelle8. Ein weiterer Vorteil des statistischen Charakters der die vorgestellte Methode ist auch im Protokoll dargestellt: die Methode kann mehrere Instanzen von finite-Elemente-Geometrien, die genau die experimentell beobachteten Schwankungen der Zellstruktur imitieren generieren.
Im Überblick, die Protokoll-Schritte umfassen: (i) Vorbereitung von Herzgewebe für Elektronenmikroskopie erzeugen 3D-Bilder mit ausreichender Auflösung und Kontrast; (Ii) Wiederaufbau und Segmentierung von 3D-Bild Stacks von Elektronenmikroskopie Daten mit Hilfe eines 3D Elektronenmikroskopie Wiederaufbau- und Bildanalyse-Software namens IMOD20; (Iii) Verwendung von iso2mesh21 , um ein finite-Elemente-Netz mit den segmentierten Daten als Eingabe zu erzeugen; (iv) unter Verwendung neuartiger Algorithmus und Codes, die Verteilung von Ionenkanälen auf das finite-Elemente-Netz abzubilden.
Die Prämisse des Ansatzes für jeden Schritt wird im Rahmen des Protokolls, und repräsentative Ergebnisse sind in den beigefügten Abbildungen zur Verfügung gestellt. Eine Übersicht ist skizziert angeben, wie die generierten räumlich detaillierte Modelle verwendet werden können, um die räumliche Dynamik von Calcium während ECC sowie mitochondriale Bioenergetik zu studieren. Einige der aktuellen Einschränkungen des Protokolls werden besprochen, sowie Neuentwicklungen, die unternommen werden, um sie zu überwinden und weiter ein quantitatives Verständnis der Rolle der Zellstruktur zu kardialen Systembiologie. Auch wird angesprochen, wie diese Methoden verallgemeinert werden könnten, um finite Elemente Modelle von anderen Zelltypen zu erstellen.
Benutzer dieses Protokolls können Schritt 1 und der Wiederaufbau Teil von Schritt 2 überspringen, wenn sie Zugang zu einer bereits vorhandenen Elektronenmikroskopie-Bildstapel haben. Benutzer, die beabsichtigen, ihre Daten in Zusammenarbeit mit erfahrenen Elektron Mikroskopiker erwerben möchten diskutieren und vergleichen Sie die Fixierung und Färbung Verfahren in Schritt 1 mit dem Experten um eine optimale Protokoll für den Erwerb zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll beschreibt wichtige Schritte, um ein neuartiges finite-Elemente geometrischen Modell des Cardiomyocyte Ultrastruktur erzeugen. Die Methode ermöglicht rechnerische Verschmelzung der verschiedenen Mikroskopie (oder andere Daten grundsätzlich) Modalitäten eine umfassendere Computermodell der Cardiomyocyte Dynamik entwickeln, die Details der räumlichen Zellarchitektur enthält. Derzeit gibt es kein anderes Protokoll zur Verfügung, um ein solches Modell für eine Cardiomyocyte zu erstellen.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Royal Society von New Zealand Marsden schnell starten Grant 11-UOA-184, Human Frontiers Science Programm Research Grant RGP0027/2013 und die australische Forschung Rat Discovery Project Grant DP170101358 unterstützt.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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