리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화
Summary
변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.
Abstract
단백질으로 mRNA의 번역 규칙의 여러 레이어를 포함 하는 복잡 한 공정 이다. 그것은 종종 가정 mRNA 녹음 방송에 있는 변화 단백질 합성, 변화를 반영 하지만 많은 예외 관찰 되었습니다. 최근, 리보솜 프로 파일링 (또는 Ribo-Seq) 이라는 기술을 mRNA의 어떤 영역 단백질 및 게놈 넓은 수준에서 번역의 정량화로 번역 된다 높은 정확도 식별, 수 있도록 강력한 방법으로 떠오르고 있다. 여기, 선물이 신진 효 모에 Ribo-Seq를 사용 하 여 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 일반화 된 프로토콜. 또한, mRNA 풍부 측정 Ribo-Seq 데이터를 결합 수 있습니다 동일한 샘플에서 mRNA 사본의 수천의 번역 효율을 동시에 계량 하 여 비교 실험에 대 한 응답에서 이러한 매개 변수에서 변경 조작 또는 다른 생리 적인 상태에서. 우리는 리보솜 발자국 nuclease 소화, 자당 그라데이션 분류를 통해 그대로 리보솜-풋프린트 단지의 고립과 DNA 라이브러리의 준비를 사용 하 여 적절 한 함께 깊은 시퀀싱에 대 한의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 설명 vivo에서 번역의 정확한 분석을 위해 필요한 품질 제어 합니다.
Introduction
mRNA의 번역 단백질 식의 규칙에 있는 중요 한 역할 셀에 기본적인 프로세스 중 하나입니다. 따라서, mRNA 번역은 밀접 하 게 다른 내부 및 외부 생리 자극 1,2에 대 한 응답 제어 됩니다. 그러나, 변환 규칙의 메커니즘 understudied 남아 있습니다. 여기, 우리는 리보솜 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 리보솜 프로 파일링 기법의 전반적인 목표는 연구 하 고 계량 다른 세포질 조건 하에서 특정 한 mRNAs의 번역입니다. 이 기술은 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 게놈에 걸쳐 리보솜 인 양적 분석을 하며 단백질 합성에서 vivo에서 단일 codon 해상도 3,4속도 모니터링 현재,이 방법은 단백질 번역의 수준을 측정 하는 가장 고급 방법을 이며 다른 현재 사용할 수 있는 기술, 예를 들면 microarrays에 의해 밝혀질 수 없는 정보를 제공 하는 유용한 검색 도구 입증 또는 번역 상태 배열 분석 (TSAA) 5. 성적 수준 및 변환 출력에 결합 된 변화에 대 한 보고서를 프로 파일링 하는 리보솜으로 그것은 또한 다른 방법에 비해 훨씬 더 큰 감도를 제공 합니다.
이 방법은 mRNA 파편 리보솜 보호 3의 깊은 시퀀싱을 기반으로 합니다. 리보솜 단백질 번역 동안 보호 ~ 28 nt 부분의 mRNA (발자국 이라고 함) 6. 리보솜 보호 조각의 순서를 결정 하 여 Ribo-Seq 번역된 mRNA에 리보솜의 위치를 지도 하 고 적극적으로 단백질 3,7로 번역 될 것 mRNA의 어떤 영역을 식별할 수 있습니다. 또한, 우리 양적 발자국을 주어진된 mRNA 사본 수를 계산 하 여 mRNA의 번역을 측정할 수 있습니다.
리보솜 보호 조각을 분리 하기 위하여 세포 lysates 처음 ribonuclease 소화 다음 리보솜에 번역 억제제 처리 됩니다. 반면 무료 mRNA, 리보솜에 의해 보호 되지 않는 번역 된 mRNAs의 일부는 ribonuclease에 의해 타락, 리보솜 보호 mRNA 파편 그대로 리보솜-풋프린트 단지 정화 하 여 복구할 수 있습니다. 이 mRNA 발자국 cDNA 도서관으로 변환 그리고 깊은 시퀀싱 (그림 1)에 의해 분석 됩니다. 리보솜 프로 파일링을 병렬로 그대로 mRNA는 동일한 샘플에서 추출 하 고 시퀀스. MRNA 풍부 측정 Ribo-Seq로 식별 하는 번역의 수준을 비교 하 여 특별히 업 또는 다운-규제 번역의 수준에는 유전자를 식별 하 고 게놈 넓은 수준에서 mRNA의 번역 효율을 계산할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 프로토콜은 효 모에 대 한 구체적인, 하는 동안 그것은 유용 해야 한다 또한 연구자 다른 시스템에서 Ribo-Seq 프로토콜을 설정 하려고 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ribo-Seq 접근 mRNA 번역에서 vivo에서 게놈 넓은 레벨 3에서 분석을 위한 강력한 기술로 떠오르고 있다. 연구 모니터링 단일 codon 해상도 번역에서는이 방법을 사용 하는 변환 규칙에 대 한 우리의 이해에 기여 했다. 자사의 장점에도 불구 하 고 Ribo-Seq는 몇 가지 제한이 있습니다. 리보솜 RNA (rRNA) 조각 리보솜 보호 발자국 Ribo-Seq 실험 9,25</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 AG040191 및 AG054566 VML에 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 이 연구는 VML 노화 연구를 위한 미국 연맹에서 멀리 연구 보조금 받는 동안 실시 됐다.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
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