Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования
Summary
Переводческая регулирование играет важную роль в элементе белка изобилия. Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью для количественного анализа перевода в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Перевод мРНК на белки — сложный процесс, с участием нескольких слоев регулирования. Часто предполагается, что изменения в мРНК транскрипции отражают изменения в синтезе белка, но было отмечено много исключений. Недавно называемый рибосома профилирования (или Рибо-Seq) возник как мощный метод, который позволяет идентифицировать, с высокой точностью, какие регионы мРНК переводятся на белки и количественная оценка перевода на уровне генома всей. Здесь мы представляем обобщенных протокол для количественного определения генома общесистемной перевода с помощью Рибо-Seq в многообещающий дрожжей. Кроме того сочетая Рибо-Seq данных с мРНК изобилие измерений позволяет нам одновременно количественную оценку эффективности перевода тысяч мРНК стенограммы в том же образце и сравнить изменения этих параметров в ответ на экспериментальной манипуляции или в различных физиологических состояниях. Мы описываем подробный протокол для поколения рибосома контуры с помощью нуклеиназы пищеварение, изоляции нетронутыми рибосомы след комплексов через сахарозы градиента фракционирования и подготовки ДНК библиотек для глубокой последовательности вместе с соответствующей контроль качества, необходимые для обеспечения точного анализа в естественных условиях перевода.
Introduction
мРНК перевод – один из основных процессов в клетке, которая играет важную роль в регуляции экспрессии белков. Таким образом перевод мРНК жестко контролируется в ответ на различные внутренние и внешние физиологические стимулы 1,2. Однако механизмы регуляции поступательные остаются изученными. Здесь мы описываем протокол для количественного определения генома общесистемной перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования. Общая цель метода профилирования рибосома является изучение и количественно перевод конкретные мРНК условиях различных клеточных. Этот метод использует секвенирование нового поколения для количественного анализа рибосома размещение на протяжении всего генома и позволяет контролировать уровень белка синтеза в естественных условиях на один кодон резолюции 3,4. В настоящее время, этот метод обеспечивает наиболее передовые средства измерения уровня белка перевода и оказался полезным открытием инструментом предоставления информации, которые не могут быть выявлены путем других имеющихся в настоящее время методов, например microarrays или перевод состояния массива анализ (TSAA) 5. Как рибосомы, отчеты о комбинированных изменения в уровнях Стенограмма и трансляционная вывода профилирования она также обеспечивает намного большую чувствительность, по сравнению с другими методами.
Этот подход основан на глубокой sequencing рибосомы защищенные мРНК фрагменты 3. В процессе перевода протеина, защищать рибосомы ~ 28 части nt мРНК (так называемый следы) 6. Определяя последовательность фрагментов рибосомы защищенный, Рибо-Seq можно сопоставить положение на переведенные мРНК рибосомы и определить, какие регионы мРНК, вероятно, активно воплощаться в протеин 3,7. Кроме того мы можем количественно измерить перевод мРНК, подсчитывая количество следов, которые присоединяются к стенограмме заданный мРНК.
Для того, чтобы изолировать фрагменты защищенных рибосомы, lysates клетки первоначально рассматриваются с ингибитор перевода в стойло рибосомы, следуют рибонуклеазы пищеварение. В то время как свободные мРНК и часть переведенных мРНК не защищены рибосомы деградировали, рибонуклеаза, фрагменты мРНК рибосомы защитой могут быть восстановлены очищая нетронутыми рибосомы след комплексов. Эти следы мРНК затем преобразуется в библиотеку cDNA и анализируемой глубокую последовательности (рис. 1). Параллельно для профилирования рибосомы нетронутыми мРНК извлекается из того же образца и виртуализации. Сравнивая уровень перевода определенных Рибо-Seq с мРНК изобилие измерения, мы можем выявить гены, которые специально вверх или вниз регулируемой на уровне перевода и рассчитать эффективность перевода мРНК на уровне генома всей. В то время как протокол, описанные в этой статье является специфичным для дрожжей, она должна быть также полезной для исследователей, которые будут пытаться установить протокол Рибо-Seq в других системах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рибо-Seq подход стал мощной технологии для анализа мРНК перевод в естественных условиях в геноме общесистемного уровня 3. Исследования с использованием этого подхода, который позволяет следить за перевод с одного кодон резолюции, способствовала нашего понимания транс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов AG040191 и AG054566 в VML. Это исследование было проведено в то время как VML — Кавалер Афар исследовательский грант от американской Федерации за старение научных исследований.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
