Nåværende protokollen beskriver en fremgangsmåte av fisk sperm vurdering computer-assistert sperm analyse og kjøling enheter. Programvaren gir en rask, nøyaktig og kvantitativ analyse av fisk sperm kvalitet basert på spermatozoa motilitet, som kan være nyttig verktøy i akvakultur å forbedre reproduksjon suksess.
For Kjønnscelle kvalitet evaluering finnes det nyskapende, rask og kvantitative teknikker som kan gi nyttig informasjon for akvakultur. En av de oftest måles er Spermiemotilitet datastyrte systemer for sperm analyse ble utviklet for å måle flere parametere.
I utgangspunktet ble denne datateknologi utviklet for pattedyrarter, selv om det kan også brukes for fisk sperm analyse. Fisken har bestemte funksjoner som kan påvirke sperm vurdering som en kort motilitet tid etter aktivering og, i noen tilfeller tilpasning til lavere temperaturer. Derfor er det nødvendig å endre både programvare og maskinvare komponenter slik at motilitet analyse mer effektiv for fisk sperm analyse. Pattedyr sæd brukes varmeplaten å opprettholde optimal temperatur spermatozoa. Men for noen fiskearter er det en fordel å bruke en lavere temperatur for å forlenge varigheten av motilitet, siden sperm forblir aktive for mindre enn 2 minutter. Kjøling enheter er derfor nødvendig å kjøle samples ved konstant temperatur over tid analyse, inkludert på optisk mikroskopet. Denne protokollen beskriver analyse av fisk Spermiemotilitet programvare for sperm analyse og nye kjøleenhetene å optimalisere resultatene.
Effekten av reproduksjon, avhenger av kvaliteten på begge gameter (egg og sperm)1,2. Dette er den viktigste faktoren som bidrar til vellykket befruktning, slik at utviklingen av levedyktig avkom3,4. Praktisk evaluering av Kjønnscelle kvalitet er det beste verktøyet for å definere fruktbarhet potensialet i en prøve.
Blande sperm fra flere menn er en vanlig praksis i produksjon av mange kommersielle dyrearter4. Men sperm variasjon mellom menn kan føre til sæd konkurranse, og derfor ikke alle menn like bidrar til gener5. I denne forstand er riktig evaluering av personlige ejakulere/spermatozoa funksjoner, for eksempel motilitet, grunnleggende for få diskriminerende informasjon om individuelle mannlig fertilitet potensielle. Direkte observasjon av Spermiemotilitet kan gi unøyaktige og subjektive data som det krever tid og erfaring, som fører til manglende konsistens og uforlikelighet resultater6,7. Det er imidlertid mange nyskapende, rask og kvantitative teknikker som kan gi et pålitelig sperm kvalitet analyse2,4.
Computer-assistert sperm analyse ble utviklet for å gi nøyaktige data om sperm kvalitet8. Denne teknologien inkluderer utvikling av programvare som er knyttet til fase kontrast mikroskop som lar vurdering av Spermiemotilitet. En begrensende faktor motilitet parameteren er imidlertid bildefrekvens videokameraet. Individuelle spermatozoa baner er basert på spermatozoa leder centroid posisjon i påfølgende rammer på videoopptak, som er forbundet med flagellar bevegelse mønstre3,9,10, 11. de viktigste kinetic parametrene målt er lineære hastighet (VSL), beregner hastighet (VCL) og gjennomsnittlig banen hastighet (VAP). VSL er avstanden mellom start- og sluttpunktet tatt av spermatozoa delt tid. VCL er reelle hastigheten langs nøyaktige banen tatt av spermatozoa. VAP er hastigheten langs en avledet buede banen til banen. Disse parametrene kan kinetic tilleggsinformasjon, inkludert linearitet (LIN), rett linje (STR), vingle (WOB) og slo målinger som amplituden av hodet vridning (ALH) og beat-cross frekvens (milliarder Kubikkfot)4,10.
Sperm analyse systemet ble opprinnelig brukt til pattedyrarter, og et av kravene for systemet er å operere på kroppstemperaturen av donor (ca 37 ° C). Denne programvaren kan også brukes til fiskearter; Selv om det er nødvendig å gjøre noen tilpasninger å redusere antallet sperm analyseresultater. I enkelte fiskearter, som laks og ål8,12, oppstår befruktning ved lav temperatur (rundt 4 ° C)2,4. Dermed skal kjøleenheter utvikles for å unngå ubehagelig arbeidsforhold. I tillegg fisk spermatozoa er immotile i seminal væske og krever en osmotisk sjokk å aktivere motilitet. For ferskvannsarter ha aktivator mediet hypotonisk osmolality, mens for marine arter medium bør være hypertonic. Men for noen arter kan som laks, konsentrasjonen også være viktig3,4,9. Etter aktivisering, er fisk sperm preget av en svekkelse av motilitet (mindre enn 2 min)13,14 og høy hastighet, blir viktig å fastslå den optimale bildefrekvensen for å få pålitelige data15.
Målene med denne studien er å designe og bruke kuldeanlegg for fisk sperm prøver. I tillegg definerer denne protokollen fastslå de optimale bildefrekvens for etablering av standardprotokoller avhengig av arten. Bruk av denne protokollen åpner nye dører i sammenheng med fisk banebrytende evaluering, med europeisk som modell.
Sperm analyseprogramvare brukes i denne protokollen er brukt av forskere over hele verden for ulike arter, inkludert fisk. Men har fisk noen spesielle funksjoner som kan påvirke sperm vurdering. Fisk spermatozoa viste høy hastighet i øyeblikket aktivisering hvilke avtar raskt og fører til kort tid for motilitet etter aktivering. Dessuten temperaturen på reproduksjon er avhengig av arter, og i noen tilfeller kunne rundt 4 ° C2,4,…
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har mottatt finansiering fra kostnaden Association (mat og landbruk pris handling FA1205: AQUAGAMETE og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie Sklodowska-Curie prosjekt imponere (GA ingen 642893). Vi vil gjerne takke vitenskapelige team av PROiSER, spesielt for studenten Alberto Vendrell Bernabéu, hans aktiv deltakelse i videoinnspillingen av dette prosjektet.
Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
Cooler block | PROiSER | Prototype | |
ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |