Utvikling av In Vitro analysen å Quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i utvikle sebrafisk embryo
Summary
Her presenterer vi en enkel metode for å quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i embryonale sebrafisk. HSPCs fra avstand sebrafisk er belagt i methylcellulose med støttende faktorer, skille i eldre blod. Dette gjør påvisning av blod defekter og lar narkotikarelaterte screening for å utføres enkelt.
Abstract
Hematopoiesis er en viktig mobilnettet prosess der blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) skille ut en rekke ulike celle linjene som utgjør modne blod. Isolasjon og identifikasjon av disse HSPCs er vanskelig fordi de definerte ex post facto; de kan bare defineres etter deres differensiering inn bestemt celle overleveringslinjer. De siste tiårene, har sebrafisk (Danio rerio) blitt en modell organisme til å studere hematopoiesis. Sebrafisk embryo utvikle ex uteroog av 48 timer etter befruktning (hpf) har generert definitive HSPCs. analyser for å vurdere HSPC differensiering og spredning evner er utviklet, utnytte transplantasjon og påfølgende rekonstituering blodkreft systemet i tillegg til visualisere spesialiserte transgene linjer med AC confocal mikroskopi. Men er disse analyser kostnader uoverkommelige, teknisk vanskelig og tidkrevende for mange laboratorier. Utvikling av en i vitro modell å vurdere HSPCs ville være kostnadseffektive, raskere, og presentere færre problemer sammenlignet med tidligere beskrevet metoder, gir laboratorier for å vurdere mutagenese og narkotika skjermer som påvirker HSPC biologi. Denne romanen i vitro analysen å vurdere HSPCs utføres av plating dissosiert hele sebrafisk embryoer og legge ytre faktorer som fremmer bare HSPC differensiering og spredning. Embryo er atskilt i enkeltceller og belagt med HSPC-støttende koloni stimulerende faktorer som forårsaker dem til å generere kolonien danner enheter (CFUs) som oppstår fra en enkelt stamfar celle. Disse analyser bør tillate mer nøye undersøkelse av molekylære veier HSPC spredning, differensiering og regulering, som tillater forskere å forstå grunnlaget for virveldyrenes hematopoiesis og dens feilregulering under sykdom.
Introduction
Hematopoiesis er prosessen med å lage mange eldre blod celler kreves for en organismes overlevelse. Det er en nøkkel utviklingsprosess som involverer differensiering av blodkreft stamceller (HSCs) til en rekke developmentally begrenset celletyper som utgjør modne blod. Disse HSCs må selv fornye slik at systemet aldri er oppbrukt og de må beholdes fra embryonale utviklingen til død. I virveldyr, konstant differensiering og spredning av blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) er nødvendig for å tilstrekkelig fylle fleste blod celler som post mitotisk og blir resirkulert hver dag. HSCs genererer eldre blod celler ved første skille i undergrupper av begrenset stamfar celler. vanlige lymfoide progenitors (CLPs)1, som til slutt produsere T, B og NK celler, og vanlige myelogen progenitors (CMPs)2 som genererer granulocytter, erytrocytter, makrofager og megakaryocytes. Disse progenitors er forpliktet til å generere bestemt celle overleveringslinjer og ytterligere skille ut flere developmentally begrenset stamfar celler som myelogen erythroid progenitors (parlamentet) som genererer erytrocytter og blodplater, eller granulocytt macrophage progenitors (GMPs) som genererer basofile, eosinofile, nøytrofile og makrofager2. Identifisere og isolere disse progenitors lar identifikasjon av viktige molekylær veier involvert i blodkreft differensiering og mange blodkreft sykdommer som leukemi oppstår når disse progenitor celler ikke riktig skille.
De siste tiårene, har sebrafisk (Danio rerio) modell systemet blitt en viktig forskningsverktøy for embryonale og voksen blodkreft studier. Sebrafisk er mottakelig for genetisk analyse og phylogenetically laveste virveldyr modell arter som har en lignende blodkar og blodkreft system for mennesker. Sebrafisk embryo utvikle ex utero, og innen 48 timer post generere befruktning (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Sebrafisk er også meget fruktbar, kvinner legge over 100 egg i en enkelt clutch, slik at store og eksperimentelle replikering. Sebrafisk embryoer er optisk gjennomsiktige, slik at mikroskopiske visualisering av blodkreft systemet. Flere fluorescerende transgene linjer med sebrafisk merking HSCs som runx1: EGFP fisk9, cd41: EGFP fisk10, og kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dobbel-positive dyr, tillate live, sanntids visualisering av HSC fremveksten og ekspansjon i vivo3,4,7,8, 9. Den sebrafisk rask generasjon tid og utvikling ex utero har ført til bruk i mutagenese studier11,12,13,14,15 og narkotika screening16,17,18,19,20 for forbindelser som holder terapeutiske løftet for menneskelig blod lidelser. Total, bevaring av blodkreft systemet, tilstedeværelse og enkel utvikling av transgene linjer og rask regenerering tid har gjort sebrafisk en billig, rask, fleksibel og ideelle modell for blodkreft studier.
Mange metoder for å isolere og testing HSCs har blitt utviklet i pattedyr blodkreft systemer. Etterforskerne kan bruke en kombinasjon av celleoverflaten reseptorer å merke HSCs21,22,23,24, i tillegg til å utnytte muligheten for HSCs å middelklasseinnbyggere fargestoff25,26. Etter at de er merket, kan aktiveres av fluorescens celle sortering (FACS) deres fysisk separasjon. Krever bevise at en celle er en HSC irradiating en vert dyr for å ødelegge endogene HSPCs, transplanting antatte HSCs, og observere langsiktige, flere avstamning rekonstituering alle eldre typer blodceller. Disse analyser fungere godt i mus, som det er mange celle-overflate antistoffer mot blodkreft cellene og innavlet musen stammer som letter immun matchende for transplantasjon. Men har noen sebrafisk blodkreft celle-overflate antistoffer vært generert27, hindre identifisering og isolering av HSCs. Den vanligste måten å merke og isolere sebrafisk HSCs er med transgene dyr, der en celle-spesifikke promoter sekvens kjører et fluorescerende protein uttrykk. Studier har visualisert og nummerert HSCs i ventrale veggen av dorsalis med mikroskopi utnytte denne teknikken3,4,8,9. Andre laboratorier har generert klonal stammer sebrafisk28,29 og har utført vellykket transplantasjon i MHC-matchet dyr30. Men disse teknikkene er kostnadseffektivt uoverkommelige for mange laboratorier, teknisk vanskelig, og er tidkrevende. For å løse disse problemene, har laboratorier generert flere i vitro analyser til å teste tilstedeværelsen, prisene spredning og differensiering kapasiteten HSPCs31,32,33, 34,35,36. Disse analyser viser spredning og differensiering av HSPCs i vitro31,32,33,34,35,36, redning av blodkreft defekter36og effektiv metode for å oppdage og testing cytokiner33,34,35. De har også blitt benyttet for å identifisere gener ansvarlig for HSPC biologi31,32. I denne studien ta vi disse analyser et skritt videre, slik at kvantifisering av HSPCs i en utvikling sebrafisk fosteret. Disse analyser kan benyttes for å quantitate antall HSPCs i mutant dyr og dyr behandlet med blodkreft-nedbrytende narkotika. I hovedsak disse analyser er rask, presentere noen tekniske utfordringer, og rimelige måter å quantitate HSPC tall, undersøke deres spredning og undersøke blokker i differensiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebrafisk modell systemet har blitt en effektiv, effektiv og rimelig modell for å studere primitive og definitive virveldyr hematopoiesis. Generasjon av analyser som er rask, billig, og presentere noen tekniske problemer kan utnyttes for testing små molekyler, analysere mutant embryoer og Klargjørende molekylær trasé viktig for HSPC biologi. In vitro plating av HSPCs fra voksen sebrafisk er en effektiv metode for å studere mutagenese cytokiner og blodkreft defekter. Denne protokollen bygger på disse studi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler ble gitt av National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 til D.L.S.), California State University programmet for utdanning og forskning i bioteknologi (CSUPERB: molekylære kontroll av virveldyr blodkreft nisje til D.L.S.) og fra diplomstudium kontoret i California State University Chico (til A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
