كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية
Summary
بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام يوفر أداة واعدة للهندسة الوراثية، وتفتح إمكانية التكامل المستهدفة من المتسلسلات. يصف لنا نهاية التماثل بوساطة من الالتحاق بالعمل (هميج)-على أساس استراتيجية للحمض النووي فعالة تستهدف الاندماج في فيفو واستهدف العلاج الجيني باستخدام كريسبر/Cas9.
Abstract
كمنصة تحرير جينوم واعدة، النظام كريسبر/Cas9 بإمكانات كبيرة لكفاءة المعالجة الجينية، خاصة بالنسبة للتكامل المستهدفة من المتسلسلات. ومع ذلك، بسبب انخفاض كفاءة جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) والطفرات إينديل مختلف للغاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج)-على أساس الاستراتيجيات في عدم تقسيم الخلايا، في فيفو الجينوم التحرير ما زال يشكل تحديا كبيرا. هنا، يمكننا وصف حد التماثل بوساطة الالتحاق بالعمل (هميج)-على أساس نظام كريسبر/Cas9 للكفاءة في فيفو دقيقة التكامل المستهدفة. في هذا النظام، ناقلات الجينوم المستهدفة والجهات المانحة التي تحتوي على التماثل الأسلحة (~ 800 bp) يحف به دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) المستهدفة هي المشقوق متواليات من كريسبر/Cas9. هذه الاستراتيجية على أساس هميج يحقق التكامل التحوير كفاءة في الماوس زيجوتيس، وكذلك في خلايا الكبد في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يوفر نهج فعالة لتصحيح فوماريلاسيتواسيتاتي هيدرولاز (فاه) الطفرات في خلايا الكبد استراتيجية تستند إلى هميج وتنقذ فاه-النقص الناجم عن فشل الكبد في الفئران. مجتمعة، مع التركيز على استهداف التكامل، وتوفر هذه الاستراتيجية على أساس هميج أداة واعدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك توليد نماذج حيوانية معدلة وراثيا والعلاج بالجينات المستهدفة.
Introduction
تحرير الجينوم الدقيقة، وتستهدف في كثير من الأحيان المطلوبة لإنتاج نماذج حيوانية معدلة وراثيا والعلاجات السريرية. بذلت الكثير من الجهد لوضع استراتيجيات مختلفة لكفاءة الجينوم المستهدفة، مثل نوكلاس إصبع الزنك (زفن)، تحرير النسخ المستجيب المنشط–مثل نوكليسيس (تالينس)، ونظم كريسبر/Cas9. هذه الاستراتيجيات إنشاء فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي المستهدف (جهاز تسوية المنازعات) في الجينوم، والاستفادة من أنظمة إصلاح الحمض النووي الجوهرية، مثل جزئ المتجانسة (الموارد البشرية)1،2، ميكروهومولوجي بوساطة نهاية الالتحاق بالعمل (ميج)3 , 4 , 5، ونهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج)6،،من78 للحث على التكامل المستهدفة المتسلسلات1،9. الاستراتيجية المستندة إلى الموارد البشرية حاليا الأكثر استخداماً الجينوم تحرير نهج، وفعالة جداً في خطوط الخلايا، ولكن لا يسهل على عدم تقسيم الخلايا بسبب حدوثه المقيدة في أواخر المرحلة S/G2. وهكذا، الاستراتيجية المستندة إلى الموارد البشرية لا ينطبق للتحرير في فيفو الجينوم. في الآونة الأخيرة، وضعت استراتيجية تستند إلى نهيج للجينات كفاءة تدق في الماوس الأنسجة8. ومع ذلك، الأسلوب القائم على نج عادة ما يدخل إينديلس في الوصلات، مما يجعل من الصعب على توليد التحرير الجينوم الدقيقة، وخصوصا عندما تحاول بناء الجينات الانصهار في الإطار8. ميج-على أساس التكامل المستهدف قادر على تحرير الجينوم الدقيقة. ومع ذلك، فقط تواضع أنه يزيد من كفاءة التكامل المستهدفة في التقارير السابقة5. ولذلك، تحسين كفاءة دقيقة التكامل المستهدفة في فيفو حاجة ملحة لتطبيقات علاجية واسعة3.
في عمل نشرت مؤخرا، أثبتنا حد التماثل بوساطة الالتحاق بالعمل (هميج)-على أساس الاستراتيجية، التي أظهرت أعلى كفاءة التكامل المستهدفة في استراتيجيات كل المبلغ عنها على حد سواء في المختبر و في فيفو10. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإنشاء نظام هميج، وأيضا بناء ناقلات الجيش الملكي النيبالي (سجرنا) واحد-دليل استهداف الجين للفائدة والجهة المانحة متجهات إيواء المواقع المستهدفة سجرنا و ~ 800 شركة بريتيش بتروليوم التماثل الأسلحة (الشكل 1) . في هذا البروتوكول، كما تصف الخطوات التفصيلية لجيل من الحمض النووي تدق في الفئران وخطوات قصيرة للتكامل المستهدفة في الأنسجة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، دراسة دليل على مفهوم الاستراتيجية المستندة إلى هميج أثبت قدرته على تصحيح الطفرة فاه وإنقاذ فاه-/- الكبد الفشل الفئران، كما كشفت عن إمكانياتها العلاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية في بناء هميج المانحة والبلازميدات: (1) اختيار سجرنا مع الحمض النووي الانقسام وكفاءة عالية ومنخفضة المسافة بين موقع قطع سجرنا وكودون وقف البناء (2) السليم من المانحين هميج. كريسبر/Cas9-بوساطة الانقسام على كل ناقل المانحة التحوير (تحتوي على ~ 800 bp التماثل الأسلحة والمواقع ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها CAS أولوية البحث البرنامج الاستراتيجي (XDB02050007، XDA01010409)، وفي البحث والتطوير Hightech الوطنية د البرنامج (البرنامج 863؛ 2015AA020307)، مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (المنح تشرف 31522037، 31500825، 31571509، 31522038)، الصين الشباب برنامج المواهب ألف (أن إتش وأي)، وكسر من خلال المشروع من الأكاديمية الصينية للعلوم، مشروع “لجنة مدينة شانغهاي” للعلوم والتكنولوجيا (16JC1420202 إلى إتش وأي)، وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (معظم؛ 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
