Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada
Summary
O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.
Abstract
O ensaio de interferometria (BLI) bio-camada é uma ferramenta valiosa para a medição da proteína-proteína e interações da proteína-pequena molécula. Aqui, descrevemos primeiro a aplicação desta técnica romance livre de rótulo para estudar a interação de EAG1 humano proteínas de canal (hEAG1) com a pequena molécula PIP2. hEAG1 canal tem sido reconhecida como potencial alvo terapêutico por causa de sua superexpressão aberrante em cânceres e algumas mutações de ganho-de-função envolvida em alguns tipos de doenças neurológicas. Nós purificada proteínas de canal hEAG1 de um sistema de expressão estável mamíferos e medido a interação com PIP2 por BLI. A medida bem sucedida da cinética de ligação entre a proteína hEAG1 e PIP2 demonstra que o ensaio BLI é uma abordagem de alto rendimento potencial usada para a seleção de romance pequeno-molécula ligante em farmacologia do canal de íon.
Introduction
Como alvo as proteínas de canal de íon superfície acessível de célula com pequenas moléculas oferece um enorme potencial para a triagem de ligante e descoberta de drogas biológicas a1,2,3. Assim, um instrumento adequado é necessário para estudar a interação entre o canal iônico e pequenas moléculas e sua função correspondente. A gravação da remendo-braçadeira tem demonstrada para ser uma técnica única e insubstituível em ensaio funcional de canal de íon. No entanto, determinar se as pequenas moléculas alvo diretamente canais iônicos exigir outras tecnologias. Tradicionalmente, o ensaio de ligação do ligante radioativo foi usado para observar a cinética de ligação entre pequenas moléculas e sua proteína de canal de íon do alvo. No entanto, o uso desta técnica é limitado por causa de sua exigência em etiquetar radioativo e deteção. Além disso, a etapa pré-requisito para rotular o ligante pequeno no estudo impede seu uso em muitos tipos de canais iônicos sem ligante específico conhecido. Algumas técnicas de etiqueta livre tais como espectroscopia NMR, difração de raios x, microescala thermophoresis (MST)4 e ressonância de plasmon de superfície (SPR) tem sido usadas para medir as interações da proteína-pequena molécula. Mas esses tipos de ensaios geralmente não podem fornecer informações suficientes por causa da dificuldade para obter a proteína completo, baixa resolução de dinâmica, baixa taxa de transferência e de alto custo5. Em contraste com estas técnicas, bio-camada interferometria (BLI) está emergindo como uma metodologia romance livre de rótulo para superar estas desvantagens para detecção de interações proteína-pequena molécula por imobilizando um pequenas quantidades de amostra de proteína nas superfícies das Biosensor e medir a mudança da ótica sinais6,7. Como uma plataforma de biosensor promissor, técnica BLI já é realizada para observar a interação de moléculas pequenas com água natural proteínas solúveis como um anticorpo monoclonal humano CR80208 e o procedimento de ensaio detalhado tem sido relatado em uma anterior artigo9. Embora o papel fundamental da proteína de canal de íon para descoberta de novos alvos terapêuticos tem sido reconhecido, o ensaio de interação molécula de proteína-pequeno de canal íon baseado em BLI não foi descrito.
O ser humano canais éter à go-go (hEAG1) são expressos em vários tipos de células cancerosas e sistema nervoso central, que faz com que o canal um potencial alvo terapêutico de muitos cancros e distúrbios neuronal10,11, 12,13,14. O estudo eletrofisiológico em nosso laboratório confirmou o efeito inibitório de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2) do hEAG1 canal15. Com base em nossos resultados, teste PIP2 diretamente a interação com o hEAG1, usando a técnica BLI pode ser como um modelo para outros tipos de interação composto de íon canal molécula de proteína-pequeno especialmente para esses canais sem ligantes específicos. De acordo com as instruções de ensaio BLI, estamos preparados biotinilado hEAG1 proteínas e imobilizado-los na superfície do streptavidin (SA) dicas biosensor seguiram de interação-os para soluções de2 PIP para observar sua vinculação direta entre o proteínas e os lipídios. Após a fixação do PIP2 para hEAG1 a superfície revestida de proteína, a espessura da camada na superfície aumenta, que diretamente correlaciona o deslocamento espectral e pode ser medido em tempo real16. A cinética de ligação pode ser determinada devido a uma mudança positiva na etapa de associação e uma mudança negativa na etapa da dissociação. De acordo com este princípio, nós purificado da proteína de canal de íon hEAG1 funcional de HEK-239T expressão estável sistema usando o método de purificação de afinidade para manter o estado funcional in vitro , em seguida, medido a cinética de ligação de concentração diferente PIP2e rendeu um semblable dados cinéticos, como observado em medidas eletrofisiológicas15. A estreita correspondência entre os resultados do BLI e medições eletrofisiológicas demonstram pela primeira vez a adequação do BLI como uma ferramenta analítica adequada para interação de molécula de proteína-pequeno membrana do canal de íon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verificados como os alvos terapêuticos primários de mais de 13% de drogas atualmente conhecidas para o tratamento de uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares e neurológicos18canais iônicos de membrana. Remendo-braçadeira de gravação, o padrão ouro para medir o funcional de canais iônicos com pequenas moléculas, tem sido amplamente utilizada para ligantes de canal de íon de triagem. No entanto, tais abordagens eletrofisiológicas não podem demonstrar se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo centro de Bio-ID e SJTU fundo de investigação interdisciplinar em medicina e engenharia (YG2016QN66), Fundação Nacional de ciências naturais da China (31271217) e nacional pesquisa básica programa da China (2014CB910304).
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
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