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Biochemistry

टेम स्टेम कोशिकाओं की छोटी संख्या के लिए एक वेस्टर्न सोख्ता प्रोटोकॉल

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/56855
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2
1Division of Experimental Hematology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Southwest Hospital, Third Military Medical University

Summary

एक मानक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल ५०० टेम स्टेम या जनक कोशिकाओं के रूप में कुछ के रूप में विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था । ऑप्टिमाइज़ेशन कक्ष नमूने के सावधान हैंडलिंग, ट्यूबों के बीच स्थानांतरण सीमित, और सीधे Laemmli नमूना बफ़र में कक्षों lysing शामिल हैं ।

Abstract

टेम स्टेम सेल (HSCs) दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं, माउस के साथ अस्थि मज्जा युक्त केवल ~ २५,००० phenotypic दीर्घकालिक HSCs । एक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल अनुकूलित और HSCs की छोटी संख्या (५००-१५,००० कोशिकाओं) के विश्लेषण के लिए उपयुक्त था । Phenotypic HSCs शुद्ध थे, सही गिना, और सीधे Laemmli नमूना बफर में लीजड ड । कोशिकाओं के बराबर संख्या युक्त Lysates सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) द्वारा विश्लेषण किया गया था, और दाग तैयार किया गया था और मानक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल के बाद संसाधित । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, २,०००-५,००० HSCs नियमित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है, और कुछ मामलों में डेटा के रूप में कुछ के रूप में ५०० कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है, २०,००० से ४०,००० कोशिकाओं को सबसे प्रकाशनों में रिपोर्ट की तुलना में । इस प्रोटोकॉल आम तौर पर अंय टेम कोशिकाओं के लिए लागू किया जाना चाहिए, और मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का उपयोग कर कोशिकाओं की छोटी संख्या के नियमित विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।

Introduction

टेम स्टेम सेल (HSCs) स्व-नवीकरण कोशिकाओं है कि सभी रक्त वंश को जंम दे सकते हैं । वे अस्थि मज्जा में अपेक्षाकृत दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं, जैव रासायनिक विश्लेषण मुश्किल प्रतिपादन । इस तरह के प्रवाह cytometry के रूप में दुर्लभ कोशिकाओं, विश्लेषण के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण, सेल सतह मार्करों और intracellular प्रोटीन के सापेक्ष मात्रा को बढ़ाता है के लिए अत्यंत उपयोगी है । हालांकि, intracellular प्रोटीन के विश्लेषण एंटीबॉडी पहुंच सक्षम करने के लिए सेल permeabilization प्रक्रियाओं का उपयोग आवश्यक, और नहीं सभी सेल सतह epitopes बच इन प्रक्रियाओं1,2। इसके अलावा, एंटीबॉडी कि विभिंन प्रोटीन isoforms या दरार उत्पादों के बीच भेदभाव अक्सर प्रवाह cytometry के लिए उपलब्ध नहीं हैं, और इसलिए जांचकर्ताओं अभी भी विश्लेषण के कुछ प्रकार के लिए पश्चिमी दाग पर भरोसा करते हैं ।

सेल lysates के पश्चिमी दाग विश्लेषण अधिकांश प्रयोगशालाओं में एक नियमित प्रक्रिया है । कोशिकाओं को देशी शर्तों के तहत शुद्ध किया जा सकता है कि कोशिका सतह अणुओं के epitopes की रक्षा, और सेल lysates बाद में तैयार किया जा सकता है और विश्लेषण । हालांकि, पश्चिमी दाग द्वारा दुर्लभ प्राथमिक कोशिका आबादी में प्रोटीन के विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पशुओं के euthanizing बड़ी संख्या की आवश्यकता हो सकती है । कई कदमों के लिए छोटे समायोजन करने से, एक पारंपरिक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल HSCs की अपेक्षाकृत छोटी संख्या में प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम था (५००-१५,०००, ब्याज के प्रोटीन पर निर्भर करता है) । समायोजन सही कोशिकाओं की गिनती शामिल हैं, ध्यान से हैंडलिंग सेल गोली, ट्यूबों के बीच कोशिकाओं के स्थानान्तरण को कम करने के लिए सेल नुकसान को कम करने, और lysing एक केंद्रित लोडिंग बफर के साथ कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या proteasome युक्त और फॉस्फेट अवरोधकों । कई प्रकाशित रिपोर्टों पश्चिमी २०,००० या अधिक HSCs3,4,5,6,7के साथ प्राप्त दाग शामिल हैं; यह सरल प्रक्रिया के बीच 4 और ४० गुना द्वारा समकक्ष डेटा का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं और प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या कम हो जाएगा । प्रोटोकॉल के बजाय एक आंतरिक नियंत्रण करने के लिए, प्रति कक्ष आधार पर परिणामों को सामान्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रोटीन के स्तर में समग्र कटौती का पता लगाने में सक्षम बनाता है कि अगर डेटा एक आंतरिक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है अनदेखी कर सकते हैं । प्रति कोशिका आधार पर सामान्य करने का महत्व जीन अभिव्यक्ति डेटा8के विश्लेषण के लिए वर्णित किया गया था, और एक ही सिद्धांत पश्चिमी दाग द्वारा बढ़ाता प्रोटीन पर लागू होता है । इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए कोशिकाओं की छोटी संख्या का विश्लेषण करने की जरूरत किसी के लिए उपयोगी होना चाहिए ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु का उपयोग करें और देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए । प्रक्रिया murine टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSCs और HPs) के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था, लेकिन अंय कोशिका आबादी के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

1. Murine HSCs और HPs का प्रवाह Cytometry अलगाव

  1. फसल murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं के रूप में साहित्य में वर्णित6.
    नोट: चित्रा 1 और चित्रा 2में प्रस्तुत आंकड़ों में, अस्थि मज्जा C57BL/6J चूहों से काटा गया था ।
  2. अस्थि मज्जा एक माउस वंश कमी किट का उपयोग कर कोशिकाओं के वंश घट प्रदर्शन, निर्माता के निर्देशों का पालन ।
  3. 7वर्णित के रूप में ब्याज की सेल सतह मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन । में दिखाए गए प्रयोगों में चित्रा १ और चित्रा २, एंटीबॉडी टू Sca-१, किट, Flt3, और वंश (लिन) मार्करों Mac1, Gr1, CD3e, B220, और Ter119 का उपयोग किया गया है.
  4. क्रमबद्ध करें २,०००-२०,००० लिन- Sca1+किट+ Flt3- कोशिकाओं (HSCs) या लिन-Sca1-किट+ कोशिकाओं (HPs) में १.५ एमएल Eppendorf 2% भ्रूण गोजातीय के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ०.१ मिलीलीटर युक्त ट्यूबों सीरम (FBS) ।
    नोट: चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया डेटा के लिए, कोशिकाओं को एक ७० µ मीटर नोक के साथ एक प्रवाह Cytometer का उपयोग कर हल किया गया. संग्रह की अधिकतम मात्रा १.४ मिलीलीटर है ।

2. नमूना तैयारी

नोट: यह चरण महत्वपूर्ण है । नमूना प्रक्रिया बहुत सावधानी से । जब supernatant को हटाने, बहुत सावधान सेल गोली परेशान नहीं हो ।

  1. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों 4 डिग्री सेल्सियस, ५०० एक्स जी में एक झूलते बाल्टी रोटर में क्रमबद्ध कोशिकाओं से युक्त, 5 मिनट के लिए, लेकिन सभी को हटाने के लगभग १०० µ एल सेल गोली से supernatant बहुत धीरे एक पिपेट और एक 20 µ एल प्लास्टिक टिप का उपयोग कर । गोली परेशान मत करो ।
    1. नमूने से कम ५,००० कक्षों में हैं, और सॉर्ट किए गए नमूने का कुल वॉल्यूम ०.२ मिलीलीटर से कम है, तो पहले कम बाइंडिंग ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों के लिए कक्षों को स्थानांतरित करें ।
    2. यदि नमूने से कम ५,००० कोशिकाओं है और मात्रा से अधिक ०.२ मिलीलीटर है, कोशिकाओं को स्पिन के साथ नीचे 4 ° c, ५०० x g पर एक केंद्रापसारक, 5 मिनट के लिए, और सभी लेकिन supernatant के २०० µ एल हटा दें । supernatant के शेष २०० µ एल में छर्रों कोशिकाओं को फिर से निलंबित, तो ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और नीचे फिर से स्पिन । दूसरी स्पिन और फिर से निलंबित कोशिकाओं के बाद गोली से सभी लेकिन 20-30 µ एल निकालें ।
  2. ट्यूब में छोड़ दिया supernatant में कोशिकाओं resuspend. यदि आवश्यक हो, तो 2% FBS/पंजाबियों में अतिरिक्त पंजाबियों जोड़ें (आप भी 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)/PBS, या अकेले पंजाबियों का उपयोग कर सकते हैं) एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 5 x104 से 5 x 105 कोशिकाओं/
    नोट: कक्षों को निलंबित करने के लिए उपयोग किए गए वॉल्यूम का अनुमान लगाने के लिए cytometry द्वारा एकत्रित कक्ष गणना का उपयोग करें ।
  3. एक स्वचालित सेल काउंटर (निर्माता के निर्देशों का पालन) या एक hemocytometer9का उपयोग कर एक सटीक सेल एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए पुनः निलंबित कोशिकाओं के 2-5 µ एल का उपयोग करें ।
  4. नए १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए कोशिकाओं की वांछित संख्या वाले पुनः निलंबित कोशिकाओं के एक खंड स्थानांतरण । चित्र 1, २,०००, १,००० या ५०० में प्रयोग के लिए HSCs या HPs स्थानांतरित किए गए थे । कोशिकाओं की वांछित संख्या पश्चिमी दाग द्वारा प्राप्त संकेत की ताकत पर निर्भर करता है, और empirically निर्धारित किया जाता है । एक 20 µ l या १०० µ l Eppendorf पिपेट टिप का उपयोग कर स्थानांतरण निष्पादित करें ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस, ५०० एक्स जी, 5 मिनट के लिए में एक झूल बाल्टी रोटर में कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  6. 100x स्टॉक समाधान उत्पंन करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार DMSO में proteasome और फॉस्फेट अवरोधकों को भंग करना ।
  7. 2x Laemmli नमूना बफर तैयार 4x Laemmli नमूना बफर के साथ विनिर्माता द्वारा प्रदान की एक समतुल्य मात्रा आसुत जल कमजोर द्वारा । 2x Laemmli नमूना बफर में 2x अवरोधकों के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए proteasome और फॉस्फेट अवरोधकों के 100x स्टॉक का एक उचित राशि जोड़ें ।
    नोट: 2x Laemmli नमूना बफर पहले से बनाया जा सकता है, लेकिन proteasome और फॉस्फेट अवरोधकों तुरंत 2x Laemmli नमूना बफर जोड़ने से पहले जोड़ा जाना चाहिए (प्लस अवरोधकों) कोशिकाओं को लाइसे करने के लिए, निम्न चरण में वर्णित के रूप में सेल गोली करने के लिए.
  8. ध्यान से सेल गोली से supernatant के एक हिस्से को हटाने के लिए, और सेल गोली के साथ ट्यूब में शेष supernatant के लिए, 2x Laemmli नमूना बफर प्लस proteasome और फॉस्फेट अवरोधकों के ५०० के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक समान मात्रा में जोड़ें 1x Laemmli नमूना बफर में कक्ष/µ एल ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि आप चरण २.५ में एक ट्यूब के लिए 20 µ l के कुल वॉल्यूम में २,००० कक्षों को स्थानांतरित करते हैं, कोशिकाओं (चरण २.६) केंद्रापसारक के बाद आप गोली से supernatant के 18 µ एल निकाल देना चाहिए, और 2 µ एल supernatant की है कि एक बराबर मात्रा (2 µ एल) जोड़ शेष है 2x Laemmli नमूना बफर ५०० कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/µ एल 1x Laemmli नमूना बफर में ।
  9. गोली resuspend के रूप में जितनी जल्दी हो सके lysate उत्पंन करने के लिए । इस बिंदु पर, नमूने तुरंत एसडीएस-पृष्ठ जैल के माध्यम से electrophoresed जा सकता है, या हो सकता है तरल एन2 में जमे हुए स्नैप और भविष्य में उपयोग के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

3. ट्रो

  1. हीट ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस या उबलते पानी में 5 मिनट के लिए lysates गर्मी ।
  2. Electrophorese 1-40 µ एल के lysates (५०० से युक्त २०,००० सेल समकक्ष के माध्यम से) एसडीएस-पृष्ठ जैल के माध्यम से 100V में मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर10.
    नोट: जेल में लोड lysate की मात्रा वांछनीय संकेत उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या से निर्धारित होता है, और ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत पर निर्भर करेगा, और एंटीबॉडी की गुणवत्ता. आरेख 1 में डेटा २,०००, १,००० और ५०० कक्ष lysate के समकक्ष के साथ प्राप्त किए गए थे । अच्छी तरह की चौड़ाई 3 मिमी से १.५ मिमी की सीमा में होना चाहिए । १.५ mm दांत कैंची का उपयोग व्यापक दांत के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कंघी से काटा जा सकता है ।

4. स्थानांतरण और ब्लॉक

नोट: मानक प्रोटोकॉल11के बाद एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन । चरण संक्षेप में यहां उल्लिखित हैं:

  1. 10 एस के लिए मेथनॉल के साथ एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली का इलाज, तो आसुत पानी के साथ संक्षिप्त झिल्ली धो लो ।
  2. स्थानांतरण तंत्र के निर्माता द्वारा उपलब्ध कराए गए मैनुअल में दिए गए निर्देशों का पालन करने के लिए एसडीएस-पृष्ठ जेल से झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरण ।
  3. स्थानांतरण के बाद, PBST में 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के 2 मिलीलीटर के साथ झिल्ली ब्लॉक 4 ° c पर रातोंरात (०.१% के बीच) मानक प्रोटोकॉल11निंनलिखित ।

5. एंटीबॉडी लेबलिंग

  1. विक्रेता द्वारा अनुशंसित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक शेखर पर एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन ।
    नोट: सामग्री, एंटीबॉडी, जो हम HSCs और HPs और इसी एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए मान्य है की तालिका में, दिखाया गया है. मानक कार्यविधियां8का उपयोग कर एंटीबॉडी लेबलिंग निष्पादित करें ।

6. डिटेक्शन

  1. झिल्ली धो 3 बार, PBST में कमरे के तापमान पर प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट ।
  2. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए बढ़ाया chemiluminescence बफर के 2 मिलीलीटर के साथ झिल्ली की मशीन । निर्माता के निर्देशों, या autoradiography फिल्म और फिल्म प्रोसेसर के बाद एक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर संकेतों का पता लगाएं ।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम से ५००-२,००० शुद्ध HSCs और HPs चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाए जाते हैं. में β-actin संकेत 1 चित्रा के रूप में ५०० HSCs और एक माउस की अस्थि मज्जा से शुद्ध HPs के रूप में कुछ से पता लगाया जा सकता है. ध्यान दें कि १.५ mm कुओं में lysates लदान ३.० mm कुओं में लदान से ५०० HPs से एक बहुत मजबूत संकेत का उत्पादन किया । चित्रा 2 EIF4G के एक पश्चिमी दाग और Rps6 के फास्फारिलीकरण (पी Rps6), दोनों जिनमें से प्रोटीन के विनियमन में शामिल है12अनुवाद, HSCs में, और के साथ और HPs में स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) द्वारा उत्तेजना के बिना इन विट्रो में।

Figure 1
चित्रा 1: β-actin के लिए पश्चिमी दाग murine HSCs और HPs से lysates के साथ प्रदर्शन किया । HSCs लिन-Sca1+किट+ Flt3- कोशिकाओं के रूप में murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं समाप्त वंश से हल किया गया था, और HPs लिन-Sca1-किट+थे । कोशिकाओं के विभिन्न नंबरों से तैयार Lysates एक 12% एसडीएस-पृष्ठ जेल 1 मिमी स्पेसिंग के साथ मिनी ग्लास प्लेट का उपयोग कर तैयार के माध्यम से electrophoresed थे । ब्लाटर β-actin को एंटीबॉडी के साथ जांच की थी । ब्लाट ५०० से २,००० HPs जब lysates १.५ mm वेल्स (गलियाँ 4-6) में 3 मिमी कुओं (गलियाँ 1-2) की तुलना में लोड किए गए तुलनात्मक β-actin संकेतों से पता चलता है । Lysates से २,००० ५०० कोशिकाओं को 7 से 9 लेन पर लोड किया गया । एम, आणविक वजन मार्करों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: हौसले से पृथक HSCs के पश्चिमी दाग विश्लेषण, और HPs cytokine स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) के साथ इन विट्रो में उत्तेजित । HPs प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा शुद्ध थे, केंद्रापसारक, 2% FBS में resuspend/पंजाब, गिना, तो दो ट्यूबों में विभाजित । पहली ट्यूब में HPs एससीएफ (10 के लिए एनजी/एमएल) ३७ डिग्री सेल्सियस (+ एससीएफ) में 5 मिनट के लिए प्रेरित किया गया, और दूसरी ट्यूब में HPs एससीएफ (-एससीएफ) के अभाव में 5 मिनट के लिए प्रसंस्कृत थे । कोशिकाओं तो थे और केंद्रापसारक Laemmli नमूना बफर के साथ सेल गोली लीजड ड । HSCs शुद्ध थे और सीधे संवर्धन के बिना Laemmli नमूना बफर के साथ लीजड ड. lysates 12% एसडीएस-पेज जैल के माध्यम से १.५ mm वेल्स और electrophoresed में लोड किए गए थे । ब्लाटर को एंटीबॉडी के साथ बढ़ाव शुरुआत फैक्टर 4g (EIF4G), β-actin, और phosphorylated छोटे ribosome उपइकाई S6 (पी-Rps6) के लिए विकसित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पश्चिमी सोख्ता विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने और ऊतकों या कोशिकाओं में संकेत रास्ते के सक्रियण के लिए एक आम तकनीक है । एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया प्रक्रिया के लिए छोटे समायोजन शुरू करके, हम नियमित रूप से 15 विभिंन प्रोटीन (सामग्री की तालिका) १५,००० HSCs में पता लगाने में सक्षम थे, और कुछ मामलों में ५०० HSCs के रूप में के रूप में कुछ में । इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सही कोशिकाओं की गिनती, 2) ट्यूबों के बीच स्थानान्तरण की संख्या को कम करने, और 3) Laemmli नमूना बफर के साथ सीधे कोशिकाओं lysing. जब lysing Laemmli नमूना बफर के साथ सेल गोली, हमने पाया है कि बजाय सेल गोली से supernatant के सभी हटाने और इसे Laemmli नमूना बफर में फिर से सस्पैंड, अगर हम बजाय ट्यूब में supernatant की एक छोटी मात्रा में छोड़ दिया और एक समकक्ष जोड़ा 2x Laemmli नमूना बफर की मात्रा, हम सेल नुकसान से बचने सकता है । एक झूलते बाल्टी रोटर में कोशिकाओं केंद्रापसारक भी सेल नुकसान के जोखिम में कमी आई । कंघी दांत ट्रिमिंग द्वारा अच्छी तरह की चौड़ाई को कम करने का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार ।

प्रक्रिया के लिए इन सरल समायोजन के साथ, हम reproducible परिणाम प्राप्त करने में सक्षम थे प्रकाशित पत्र है कि इस्तेमाल किया था में उन लोगों के बराबर 10-20 गुना अधिक कोशिकाओं3,4,5,6, 7. इसके अलावा, ब्लाटर मानक प्रक्रियाओं13के बाद पुनः सोख्ता के लिए छीन लिया जा सकता है, जानकारी है कि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से प्राप्त किया जा सकता है की मात्रा में वृद्धि । ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता एंटीबॉडी की गुणवत्ता और प्रोटीन बहुतायत द्वारा सीमित हो जाएगा । इस संशोधित तकनीक बहुत दुर्लभ कोशिका आबादी से प्रोटीन डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा करना हितों का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01 CA149976 (एन. ए. एस.) ने इस कार्य का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जैव रसायन १३८ अंक पश्चिमी सोख्ता टेम स्टेम कोशिकाओं छोटे सेल संख्या एसडीएस-पृष्ठ पशु परीक्षण को कम करने अस्थि मज्जा
टेम स्टेम कोशिकाओं की छोटी संख्या के लिए एक वेस्टर्न सोख्ता प्रोटोकॉल
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Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A… More

Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

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