En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Summary

En standard Western blotting protokollen var optimalisert for å analysere løpet 500 blodkreft stilk eller progenitor celler. Optimalisering innebærer forsiktig håndtering av cellen prøven begrense overføringer mellom rør og direkte lysing cellene i Laemmli eksempel buffer.

Abstract

Blodkreft stamceller (HSCs) er sjelden celler, med musen benmargen inneholder bare ~ 25.000 fenotypiske lang sikt repopulating HSCs. En vestlig blotting protokoll var optimalisert og egnet for analyse av lite antall HSCs (500-15.000 celler). Fenotypiske HSCs ble renset, nøyaktig telt og direkte lysed i Laemmli eksempel buffer. Lysates som inneholder lik antall celler ble analysert av natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), og blot var forberedt og behandlet etter standard Western blotting protokoller. Bruker denne protokollen, 2000-5000 HSCs kan analyseres rutinemessig, og i noen tilfeller kan dataene hentes fra løpet av 500 celler, i forhold til 20.000-40.000 cellene rapportert i de fleste publikasjoner. Denne protokollen skal generelt gjelder for andre blodkreft cellene og kan rutinemessig analyse av lite antall celler ved hjelp av standard laboratorium prosedyrer.

Introduction

Blodkreft stamceller (HSCs) er selv fornyende celler som kan gi opphav til alle blod overleveringslinjer. De er relativt sjeldne cellene i benmargen, rendering biokjemiske analyser vanskelig. Tilnærminger egnet for å analysere sjeldne celler, for eksempel flowcytometri, har vært svært nyttig for kvantifisere relative mengdene av cellen overflate markører og intracellulær proteiner. Imidlertid analyse av intracellulær proteiner nødvendiggjør bruk av celle permeabilization prosedyrer for å aktivere antistoff tilgang, og ikke alle cellen overflaten epitopes overleve disse prosedyrene^1,2. I tillegg antistoffer som diskriminerer mellom annet protein isoformene eller cleavage produkter er ikke ofte tilgjengelig for flowcytometri, og derfor etterforskere fortsatt stole på vestlige blots for visse typer analyser.

Western blot analyse av celle lysates er en rutinemessig prosedyre i de fleste laboratorier. Cellene kan bli renset under innfødt forhold som bevarer epitopes av cellen overflaten molekyler, og cellen lysates kan deretter forberedt og analyseres. Analyse av proteiner i sjeldne primære celle populasjoner Western blot kan imidlertid kreve euthanizing stort antall dyr å få nok celler. Ved å gjøre små justeringer flere trinn, kunne en tradisjonell vestlig blotting protokoll oppdage proteiner i relativt lite antall HSCs (500-15.000, avhengig av protein av interesse). Justeringene omfattene nøyaktig teller cellene, forsiktig håndtering celle pellets, redusere overføringer av celler mellom rør for å unngå tap av cellen, og lysing et definert antall celler med en konsentrert lasting som inneholder proteasome og fosfatase hemmere. Mange publiserte rapporter inneholder vestlige blots med 20.000 eller mer HSCs^3,4,5,6,7; Denne enkel prosedyre vil redusere antall celler og forsøksdyr kreves for å produsere tilsvarende data av mellom 4 og 40 ganger. Protokollen er utformet til å normalisere resultatene på en per celle-basis, og ikke en intern kontroll. Dette gjør påvisning av generelle reduksjoner i protein nivå som kan bli oversett hvis dataene er normalisert en intern kontroll. Betydningen av normalisere på per celle basis ble beskrevet for analyse av gene expression data⁸, og det samme prinsippet gjelder for kvantifisere proteiner ved Western blot. Denne optimaliserte protokollen bør være nyttig for alle som trenger å analysere lite antall celler.

Protocol

Alle prosedyrer må utføres i henhold til institusjonelle dyr bruk og omsorg retningslinjer. Prosedyren ble utviklet for analyse av murine blodkreft stilk og stamfar celler (HSCs og HPs), men kan tilpasses for analyse av andre celle populasjoner. 1. flyt cytometri isolasjon Murine HSCs og HPs Høste murine bein margtransplantasjon celler som beskrevet i litteraturen6.Merk: I dataene som vises i figur 1 og <strong class="xfig"…

Representative Results

Representant resultater fra 500-2000 renset HSCs og HPs er vist i figur 1 og figur 2. Β-utgangen signalet i figur 1 kan oppdages fra løpet av 500 HSCs og HPs renset fra benmargen av en musen. Merk at lasting av lysates i 1,5 mm brønner produsert en mye sterkere signal fra 500 HPs enn lasting i 3.0 mm brønner. Figur 2 er en Western blot av EIF4G og fosforylering av Rp…

Discussion

Western Blotting er en vanlig teknikk for å oppdage spesifikke proteiner og aktivering av signalveier i vev eller celler. Ved å introdusere små justeringer til en vanlig prosedyre, kunne vi rutinemessig oppdage 15 ulike proteiner (Tabell for materiale) i 15 000 HSCs, og i noen tilfeller i løpet av 500 HSCs. The Most avgjørende skritt i denne protokollen er: 1) nøyaktig teller cellene, 2) minimere antall overføringer mellom rør og 3) lysing cellene direkte med Laemmli eksempel buffer. Når lysing …

Materials

sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis