En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Summary

Standard Western blotting protokollet var optimerad för att analysera så få som 500 hematopoetiska stamceller eller stamceller. Optimering innebär noggrann hantering av cell provet, begränsa överföringar mellan rören och direkt lyseringslösning cellerna i Laemmli prov buffert.

Abstract

Hematopoetiska stamceller (Förenta) är sällsynta celler, med musen benmärgen som innehåller endast ~ 25.000 fenotypiska lång sikt återinplantering Förenta. Ett Western blotting protokoll var optimerad och lämplig för analys av litet antal Förenta (500-15 000 celler). Fenotypiska Förenta var renat, exakt räknas och direkt lyserat i Laemmli prov buffert. Lysates som innehåller lika många celler analyserades av sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), och blot var beredd och bearbetas efter standard Western blotting protokoll. Användning av detta protokoll, 2,000-5,000 Förenta kan analyseras rutinmässigt, och i vissa fall uppgifter kan erhållas från så lite som 500 celler, jämfört med 20 000 till 40.000 cellerna rapporteras i de flesta publikationer. Detta protokoll bör vara generellt tillämplig på andra hematopoetiska celler och gör rutinmässig analys av litet antal celler som använder standard laboratorierutiner.

Introduction

Hematopoetiska stamceller (Förenta) är själv förnya celler som kan ge upphov till alla blod härstamningar. De är relativt sällsynta celler i benmärgen, rendering biokemiska analyser svårt. Metoder som är lämpliga för att analysera sällsynta celler, såsom flödescytometri, har varit mycket nyttiga för att kvantifiera relativa belopp för cell yta markörer och intracellulära proteiner. Men analysen av intracellulära proteiner nödvändiggör användning av cellen vilket förfaranden att aktivera antikropp åtkomst och inte alla cell surface epitoper överleva dessa förfaranden^1,2. Dessutom antikroppar som diskriminerar mellan olika protein isoformer eller klyvning produkter inte är ofta tillgängliga för flödescytometri, och därför utredare fortfarande förlitar sig på Western blotting för vissa typer av analyser.

Western blot analys av cell lysates är ett rutinmässigt förfarande i de flesta laboratorier. Celler kan renas under inhemska förhållanden som bevarar epitoper av cell surface molekyler och cell lysates kan därefter beredd och analyseras. Analys av proteiner i sällsynta primär cell populationer av Western blot kan dock kräva euthanizing stort antal djur för att få tillräckligt med celler. Genom att göra små justeringar till flera steg, var en konventionell Western blotting protokollet kunna detektera proteiner i relativt litet numrerar av Förenta (500-15 000, beroende på proteinet av intresse). Justeringarna omfattar exakt räkna cellerna, noga hantering cellpelleten, minska överföringar av celler mellan rören att minimera cellförlust, och lyseringslösning ett definierat antal celler med en koncentrerad lastning buffert innehållande proteasom och fosfatas-hämmare. Många publicerade rapporter inkluderar Western blotting erhålls med 20.000 eller mer Förenta^3,4,5,6,7; denna enkla procedur kommer att minska antalet celler och försöksdjur som krävs för att producera motsvarande data av mellan 4 och 40 gånger. Protokollet syftar till att normalisera resultat på basis per cell, i stället för att en intern kontroll. Detta möjliggör detektering av övergripande minskning av proteinnivåer som kan förbises om data är normaliserad till intern kontroll. Vikten av att normalisera på basis per cell beskrevs för analys av gen uttryck data⁸, och samma princip gäller att kvantifiera proteiner genom Western blot. Detta optimerade protokoll bör vara användbart för alla som behöver analysera litet antal celler.

Protocol

Alla procedurer måste utföras i enlighet med institutionell användning av djur och vård riktlinjer. Förfarandet utvecklades för analys av murina hematopoetiska stamceller och stamceller celler (Förenta och HPs), men kan anpassas för analys av andra cellpopulationer. 1. flöde flödescytometri isolering av murina Förenta och HPs Skörda murina benmärgsceller som beskrivs i litteratur6.Obs: Data som presenteras i figur 1</stron…

Representative Results

Representativa resultat från 500-2,000 upprenat Förenta och HPs visas i figur 1 och figur 2. Β-aktin signalen i figur 1 kan upptäckas från så lite som 500 Förenta och HPs renats från benmärg från en mus. Observera att ladda lysates i 1,5 mm brunnar produceras en mycket starkare signal från 500 HPs än lastning i 3.0 mm brunnar. Figur 2 är en Western blot av E…

Discussion

Western Blotting är en vanlig teknik för att upptäcka specifika proteiner och aktivering av signalvägar i vävnader eller celler. Genom att införa små justeringar till en vanliga procedur, kunde vi rutinmässigt identifiera 15 olika proteiner (Tabell för material) i 15.000 Förenta och i vissa fall på så lite som 500 Förenta. The Most kritiska steg i detta protokoll är: 1) exakt räkna cellerna, (2) vilket minimerar antalet överföringar mellan rören och 3) lyseringslösning cellerna direkt …

Materials

sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis