Summary
Nous démontrons un protocole visant à normaliser les procédures d’échantillonnage d’un modèle porcin établi d’infarctus aigu du myocarde afin d’augmenter sa valeur translationnelle dans la compréhension de la physiopathologie de l’ischémie/reperfusion myocardique et de tester de nouveaux médicaments candidats.
Abstract
Reperfusion de l’ischémie myocardique (I / R) des blessures contribuent à près de la moitié de la zone nécrosée après infarctus du myocarde. À ce jour il n’y a aucun médicament approuvé pour prévenir ou réduire myocardique je / blessure de R. L’étude et la compréhension des mécanismes physiopathologiques du myocarde j’ai / R blessure est essentiel de développer des traitements efficaces. Grandes expériences animales constituent une étape importante dans les méthodes translationnelles. Le modèle porcin d’infarctus aigu du myocarde a été établi et décrit par nous-mêmes et les autres. Nous avons cherché à améliorer davantage la valeur du modèle en mettant l’accent en détail sur les techniques d’échantillonnage pour utilisation dans des expériences futures. Par ailleurs, nous insistons sur la petites mais importantes des étapes qui peuvent affecter la qualité du résultat final. Pour imiter la situation clinique du myocarde je blessure R, un cathéter intervention coronarienne percutanée (ICP) a été inséré dans le descendant artère coronaire antérieure gauche (LAD) d’un porc anesthésié. ° ° ° Ce modèle imite infarctus aigu du myocarde et le PCI traitement chez l’homme avec la possibilité de déterminer avec précision la zone à risquent ainsi que la nécrose- et tissu ischémique viable. Ici, le modèle a été utilisé pour étudier l’effet d’un inhibiteur de peptide bicyclique de FXIIa. Le modèle peut également être modifié pour permettre des délais plus longs de reperfusion étudier les effets ultérieurs de l’infarctus du myocarde.
Introduction
Cardiopathie ischémique aiguë en particulier infarctus du myocarde (MI), est la principale cause de mortalité dans les pays développés, 1. Aujourd'hui, le traitement standard de MI est une intervention coronarienne percutanée (ICP), le traitement de cathéter à ballonnet. Un des facteurs critiques qui affecte la qualité de vie et le pronostic des patients après infarctus aigu du myocarde imprégnées de PCI sont la taille de l’infarctus du myocarde. La réduction de la taille peut avoir un grand impact sur la survie et le pronostic patient 2. Ischémie/reperfusion myocardique (je / R) blessure a une influence significative sur la taille de l’infarctus du myocarde ainsi l’un des principaux objectifs en recherche cardiovasculaire est pour prévenir ou réduire myocardique je / R blessure 3. Les mécanismes exacts d’I / blessure R sont toujours sous enquête 4. Activation des cascades de plasma et les cellules endothéliales sont les maîtres mots d’I / R blessures 5. L’activation du système de coagulation est clairement impliqué 6,7. Récemment, le rôle de FXII, comme un peptide en amont début impliqué dans l’activation de la cascade de coagulation, phase de contact a été établi dans une FXII assommer modèle de rat de cérébrale j’ai / R blessure 8. Validation de ces résultats dans un modèle porcin est une étape importante dans la traduction clinique. Par conséquent, nous testons un nouvelle bicycliques (80 kDa) FXIIa inhibiteur dans le contexte du myocarde j’ai / blessure de R dans une étude pilote.
Des modèles animaux, qui imitent la situation clinique des traitements aigus de MI et PCI, sont essentielles pour améliorer notre compréhension de la physiopathologie du myocarde j’ai / blessure de R et de tester de nouveaux traitements. Porcs représentent un bon modèle animal pour clinique myocardique je / blessure de R. Ce n’est pas seulement parce que leurs coeurs sont très semblables aux coeurs humains en ce qui concerne l’anatomie et de la circulation coronaire, mais ils montrent également des réponses physiopathologiques similaires à myocardiques ischémie et reperfusion 9,10. Autres modèles tels que les rats et les souris ne pas remplir ces critères et présentent des différences considérables par rapport aux coeurs humains 11,12, alors que les chiens ont par exemple, beaucoup plus des vaisseaux coronaires collatéraux contre les humains 13.
Le modèle porcin infarctus aigu du myocarde a été largement utilisé en recherche cardiovasculaire pour étudier la maladie cardiaque ischémique, y compris myocardique je / R blessure 14,15,16,17. Ce dernier est une condition inflammatoire, à cause de laquelle minimisant la réaction inflammatoire associée à sternotomie ou thoracotomie utilisé dans la chirurgie du thorax ouvert est essentiel. Le modèle de thorax fermé à l’aide d’un contexte clinique de l’angiographie C-bras surmonte ce problème. En outre, un des points plus importants est que notre protocole prévoit une distinction précise entre ischémique (zone à risque, AAR) et les zones non ischémique du ventricule gauche (zone non en péril, ANR) afin que la taille de l’infarctus (tissus ischémiques nécrosés, NIT) peut être déterminée avec précision. Notre objectif pour le présent document est de définir clairement une méthodologie reproductible d’un porc myocardique je / blessure R modèle, en particulier en ce qui concerne le prélèvement de tissu myocardique, qui permettra une analyse plus précise des mécanismes moléculaires d’I / blessure R et un image plus claire des effets des traitements médicamenteux nouveaux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. les animaux :
Tous les animaux ont été traités conformément aux directives de la législation nationale suisse. L’étude a été approuvée par le Comité local de l’expérimentation animale du Canton de Berne (autorisation aucun. ÊTRE 25/16).
Utiliser de gros porcs blancs des deux sexes (~ 30 ± 5 kg). Diviser les animaux aveuglément en deux groupes, un groupe recevant un bicycliques (80 kDa) inhibiteur de FXIIa ou le traitement de choix et l’autre un contrôle inactif.
2. opération chirurgicale (Figure 1)
- Anesthésie et préparation de l’animal :
- Rapidement les animaux pendant 12 h avant de commencer l’expérience.
- Avant de soigner l’animal avec 20 mg/kg la kétamine et 2 mg/kg de Xylazine via une injection intramusculaire dans le cou, à l’aide d’une seringue de 10 mL. Enregistrer le poids de l’animal et le sexe.
- Induire l’anesthésie par l’injection de 0,5 mg/kg de Midazolam et 0,05 mg/kg Atropin dans la veine auriculaire. Intuber l’animal avec une sonde endotrachéale.
- Maintenir l’anesthésie par ventilation mécanique à l’aide d’un respirateur (O2/air 1:3, Sevorane 1,5 %), un tube de voies aériennes de 7-8 mm et un filtre. Ajuster la fraction d’oxygène inspiré (FiO2) à 35 % et le volume de marée de 6 à 10 mL/kg.
- Profondeur de l’anesthésie est évaluée comme adéquate en absence de réponses ni moteurs ni autonomes à vous pincer le nez. Réflexes palpébrales et le ton de la mâchoire ont été surveillés en permanence aussi bien cibler ton mâchoire détendue et absence de réflexes palpébrales. Température à cœur a été surveillée de façon continue et le maintien de la normothermie (38 à 38,5 ° C) a été assurée avec réchauffement passif (isoler les couvertures et bouteilles chaudes).
- Disséquer gratuit, comme précédemment décrits par Koudstaal et ses pas de collègues 3-1 à 3-318, les artères carotides des deux côtés et canule dans eux avec une gaine 7F. Cathétériser la veine jugulaire gauche avec une gaine 7F pour prélèvement de sang veineux.
- Administrer une dose de bolus de 250 µg analgésique de Fentanyl à travers la voie veineuse centrale suivie par 250 µg/h par perfusion intraveineuse continue à l’aide d’une pompe à perfusion. Surveiller la température corporelle, rythme cardiaque et le rythme avec une avance de 3 électrocardiogramme (ECG), la pression veineuse artérielle et centrale pendant l’expérience entière.
- À l’aide de tubes de prélèvement sanguin standard, retirer les échantillons sanguins de départ à l’adresse suivante de la ligne veineuse : 5 mL de plasma citraté et plasma EDTA 2,9 mL dans les tubes respectifs. Centrifuger immédiatement à 2 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Prendre 2,9 mL de sang dans un tube de sérum et laisser pour coaguler pendant 30 min à température ambiante avant la centrifugation comme décrit ci-dessus.
- Aliquote 200 µL de plasma ou de sérum dans 500 µL tubes et garder tous les échantillons à-80 ° C pour une analyse plus approfondie.
- Retirer 0,5 mL de sang de la ligne artérielle à l’aide de que l’analyse des gaz sanguins spéciaux (BGA) seringues pour mesurer BGA à l’aide de la machine BGA selon les instructions du fabricant.
- Retirer la ligne veineuse à l’aide d’une seringue standard de 2 mL de 0,5 mL de sang et transférer immédiatement dans la cartouche de la loi à l’aide d’une aiguille de 30 G. Insérez la cartouche remplie dans la machine ACT pour mesurer les temps de coagulation selon les instructions du fabricant. Voir la Figure 2 pour les points dans le temps.
- Administrer les 5000 IU fractionnée héparine dans la ligne veineuse à l’aide d’une seringue de 2 mL et laisser l’animal se stabiliser pendant 20 min avant de commencer l’expérience MI.
- Moniteur agissent toutes les 30-45 min comme indiqué au 2.1.11. Injecter par voie intraveineuse 2500 IU fractionnée héparine si l’acte est < 180 s.
- Expérience de l’infarctus du myocarde
- Utiliser un équipement standard de la fluoroscopie sur les bras de C (programme de coronarographie, angle 0°, 12 images par seconde, ~ 70 kV) - ou alternativement un système dédié angiographie - pour effectuer l’intervention coronaire.
- Utilisez radioscopique à insérer un cathéter de pression (5F, 120 cm) par l’intermédiaire de la gaine précédemment placée dans l’artère carotide gauche. Il avance dans le ventricule gauche. Connecter la sonde de pression d’un système d’acquisition pour enregistrer la pression ventriculaire gauche. Le système d’acquisition doit constamment calculer et enregistrer la fréquence cardiaque, mis au point de pression, dP/dt maximal (contractilité du ventricule gauche) et dP/dt minimum (relaxation du ventricule gauche) pendant l’expérience entière. Enregistrer les valeurs de base pendant 10 min.
- Insérer un 6F (100 cm, EB3.75) cathéter guide par la gaine précédemment placée dans l’artère carotide droite. Il avance à l’artère coronaire gauche pour atteindre l’artère descendante antérieure gauche coronaire (LAD) présidaient aux rayons x. Injecter le contraste à l’aide d’une seringue de 20 mL via le cathéter guide pour effectuer une coronarographie de base.
Remarque : L’Injection de produit de contraste se faisait par pression manuelle, mais un système d’injecteur de puissance dédié peut aussi être utilisé. - Évaluer la taille du garçon sur le moniteur de rayons x pour choisir la taille appropriée du cathéter intervention coronarienne percutanée (ICP). Utilisez les ballons PCI avec une longueur de 15 à 25 mm et des diamètres compris entre 2 et 3,5 mm selon la taille LAD. Assembler le cathéter PCI et guide coronaire (F 014/J, 175 cm). Raccorder le cathéter PCI avec le dispositif de gonflage pré-remplie avec contraste.
NOTE : Le diamètre LAD peut être mesuré directement sur un moniteur calibré à l’aide d’une règle et la taille du ballon PCI est alors sélectionnée en conséquence. - Insérer le système assemblé de 2.2.4 dans la lumière du cathéter-guide. Avancer le fil-guide dans le jeune garçon jusqu'à ce qu’elle va au-delà de la deuxième branche diagonale du garçon.
- Radioscopique permet de faire progresser le cathéter PCI jusqu'à ce qu’il atteigne vers le milieu du garçon. Choisissez le site blocage LAD selon l’anatomie de l’infarctus, habituellement après la seconde, parfois après le premier volet de diagonale (Figure 3) afin d’avoir des pourcentages semblables de l’AAR du ventricule gauche (VG).
Remarque : Le choix du site blocage dépend de la longueur des branches diagonales et donc la zone du tissu qui est fournie par le sang via la branche respective. Dans le cas d’une longue et bifurquée première diagonale direction le site blocage sera juste après cela. Dans le cas d’une première branche diagonale plus courte, le blocage se fait après la deuxième diagonale. - Retirer le guide et ensuite augmenter la pression dans le dispositif de gonflage à 7-10 bar pour gonfler le ballonnet de la sonde PCI et induire une ischémie du myocarde, pour 1 h. Augmentez graduellement la FiO2 à 50-60 % entre 15 et 40 min d’ischémie. Garder le volume de marée à 6-10 mL/kg.
Remarque : Cette procédure va réduire l’incidence des extrasystoles et diminuer la fréquence de Kammerflimmern. - Enregistrer une séquence vidéo de 5 à 10 s tandis que l’injection de contraste à travers le cathéter guide d’avoir une angiographie du ballonnet de la sonde PCI en place juste après le début de l’ischémie ; Répéter après 10 min d’ischémie pour vérifier l’occlusion complète du garçon distale du ballonnet de la sonde PCI.
- Surveiller l’animal près afin de détecter et de traiter (2.2.10) immédiatement des arythmies cardiaques. Extrasystoles habituellement se produisent et augmentation de la fréquence (> 3 / min) entre 20 et 40 min après l’induction de l’ischémie myocardique. Si cela se produit, masser le cou des deux côtés juste en dessous de la joue. Dans la plupart des cas, ce sera suffisant pour rétablir un rythme cardiaque régulier, probablement par la stimulation des barorécepteurs nerf vagal situé sur l’artère carotide commune.
- Si le progrès en fibrillation ventriculaire, arythmies cardiaques utiliser un défibrillateur biphasique externe, pour rétablir un rythme sinusal. Appliquer les compressions thoraciques de 5 à 10 en utilisant les touches de défibrillateur immédiatement avant d’appliquer le choc afin de combler les résultats avec le sang oxygéné et puis choc avec 150 J (pour les animaux de 30 kg).
- Réitérez l’opération si nécessaire et augmentation de l’énergie à 175 J après le choc de la 3rd . Utilisez des paramètres plus élevés de l’énergie pour les animaux plus lourds.
- Cinq minutes avant la fin de la durée d’ischémie répéter les prélèvements sanguins mentionnés dans 2.1.8-2.1.13. Injecter la substance d’essai (soit l’inhibiteur FXIIa bicyclique ou contrôler 4 mg/kg, cela cela aveuglément) par voie intraveineuse par l’intermédiaire de la voie veineuse centrale et rincer la ligne avec 20 mL de solution saline.
- Retirer un échantillon de citrate de plasma (comme mentionné dans 2.1.8 et 2.1.9) 4 min après l’injection de la substance à 2.2.12.
- Effectuer une coronarographie (2.2.3) pour confirmer l’occlusion de la DAG, puis dégonfler le ballonnet de la sonde PCI et retirer le cathéter guide de ce cathéter. Confirmer la perfusion du garçon distale sur le site de l’occlusion par angiographie immédiatement après le retrait du ballonnet de la sonde PCI, 10 min après et la déflation lorsque les signes d’ischémie myocardique étaient visibles par ECG pendant plus de 5 min et juste avant re-occlusion du garçon.
- Permettent de ré-perfusion du myocarde ischémique pendant 2 h. Prélever des échantillons de sérum et le plasma à 10, 30, 60 et 115 min de reperfusion (2.1.8 et 2.1.9). Moniteur BGA à 60 et 115 min (2.1.10).
- Réinsérez le cathéter PCI ainsi que le guide à exactement la même position que celle utilisée pour l’ischémie. Gonfler le ballonnet de la sonde PCI comme avant et confirmer l’occlusion de la DAG par angiographie (2.2.3). Retirer le cathéter de pression du ventricule gauche et arrêter l’enregistrement.
- Injecter 100 mL 2 % bleu Evans en phosphate buffered salin (PBS, pH 7,4) dans le cathéter veineux central. Environ 30 s plus tard, lorsque l’animal entier devient bleue, injecter 40 mL 20 % KCl pour euthanasier l’animal. La mort a été confirmée par l’absence des signaux ECG et des vagues d’impulsion.
3. techniques d’échantillonnage
-
Extraction, dissection et échantillonnage du cœur (figure 4)
- Effectuer une sternotomie pour exposer le cœur. Suivre le protocole décrit précédemment par Koudstaal et collègues, étapes 8-2 et 8-318. Fend le péricarde lors de l’inspection des anomalies, qui pourraient découlent de péricardite antérieure et exclure une évaluation plus approfondie de l’animal.
- Dégonfler et retirer le PCI ainsi que le cathéter guide. Le cœur pour une analyse ultérieure de l’accise. Couper la veine cave et enlever le sang à l’aide d’une pompe aspirante, puis coupez tous les grands navires reliant le cœur avec le corps.
- Rincez le cœur à l’intérieur et l’extérieur avec du sérum physiologique de la température ambiante. Peser le coeur entier.
- Dans 30-40 min, coupez le cœur en tranches d’environ 3-5 mm de l’apex de la tendinae de Chordae de la valve mitrale, perpendiculaire à l’axe longitudinal à l’aide d’un couteau bien aiguisé.
- Veillez à toujours placer le coeur dans le même sens avec la face ventrale vers le haut afin de maintenir l’orientation des échantillons coupés (Figure 5).
- Photographier les tranches du cœur à l’aide d’un numérique appareil photo reflex.
- Découper le ventricule droit (jeter pas suff). Photographier les tranches du ventricule gauche et peser toutes les tranches pour le poids total du ventricule gauche.
- La différence entre le bleu Evans positive et Evans Blue tissu négatif dans toutes les sections. Disséquer les tranches pour séparer l’ischémique (Evans Blue négatif) des tissus non ischémique (positif bleu Evans) à l’aide d’un scalpel.
- Tout d’abord analyser les sections négatives bleu Evans (la zone ischémique en péril, AAR). Pesez-les tous et mettez-les dans un récipient en plastique.
- Couvrir les tranches entièrement avec la solution de chlorure de 100-150 mL (selon la taille du coeur) triphényl tétrazolium (2Go ECC, 16 g Dextran, poids moléculaire 48000-90000, dans 200 mL de PBS, fraîchement préparé) afin que les morceaux de cœur peuvent circuler librement à l’intérieur de la solution. Couvrir le récipient et laisser incuber 20 min à 37 ° C tout en secouant doucement.
- Lors de cette pesée de temps d’incubation 20 min le bleu Evans pièces positives (zone non en péril, ANR), prélever des échantillons pour l’incorporation de tissu-Tek (choisir la partie plus distale de la lésion) et stocker à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Transférer le reste en solution à 4 % formaldéhyde et conserver à température ambiante pour les sections de l’histologie.
- Retirer les morceaux de l’AAR de la solution TTC. Le tissu teinté rouge tissu ischémique viable (VIT) et les tissus non teinté sont nécrotique tissu ischémique (NIT). Couper 2 petits morceaux (blocs de 2-3 mm) de fois la NIT et le VIT, les intégrer dans le tissu - Tek et stocker à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Ces échantillons devraient avoir le même poids.
- Corriger le reste des morceaux (tranches tous les dérivés de l’AAR) en les épinglant vers le bas dans un récipient de styromousse et recouvrant entièrement avec une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 24 h à température ambiante sous une hotte. Les morceaux doivent rester à plat pour la documentation photographique à l’étape suivante.
- Le lendemain photographier les deux côtés des pièces avec une caméra haute résolution avec la même valeur de zoom et de la distance du tissu (même grossissement). Ajouter des barres d’échelle automatique à toutes les images. Toutes les barres de besoin d’avoir la même longueur.
Remarque : La caméra haute résolution doit être connectée à un logiciel qui ajoute automatiquement la barre d’échelle à chaque photo.
-
Calcul de l’AAR et la taille de l’infarctus
- % AAR du ventricule gauche = (poids de l’AAR en g / poids du ventricule gauche dans g) * 100.
- ImageJ logiciel permet de calculer la surface totale de l’AAR et NIT (les deux côtés de chaque pièce) basée sur les photographies.
- Régler la barre d’échelle en choisissant le diapason de bar à l’aide de la ligne droite de l’outil angle. Choisissez dans le menu analyser > échelle définie et insérez l’unité de la barre d’échelle et une distance connue. Choisissez « global » pour la même ampleur s’appliqueront à toutes les images.
- Délimiter la zone toute la surface du tissu à l’aide de l’outil de sélection de main libre pour calculer l’AAR. Veillez à ne pas inclure le côté (hauteur) de tissu et/ou le tissu adipeux (figure 6-C).
- La mesure de la valeur en choisissant « espace » et « afficher l’étiquette » d’analyser > menu définir des mesures. Mesurer la superficie d’Analyze > mesure.
- Répétez l’étape 3.2.5 à mesure NIT (marque seulement le tissu non teinté). Remarque : N’incluez pas les tissus adipeux (figure 6-D) dans le calcul de NIT. Répétez l’étape de l’autre côté du tissu.
- Calculer la moyenne AAR et NIT pour chaque morceau de tissu.
- Les valeurs obtenues de 3.2.7 permet de calculer la NIT en pourcentage de la NIT AAR:% of AAR = (Σ superficie moyenne des NIT cm2/ Σ moyenne surface de AAR au cm2) * 100.
- Deux différents enquêteurs devraient répéter la méthode ci-dessus. La marge acceptable de différence est < 10 %.
-
Marqueurs de l’ischémie
- Utiliser les échantillons de plasma EDTA, qui ont été précédemment stockées à-80 ° C (2.1.9) pour mesurer le niveau de troponine-I en utilisant un dosage de type Luminex de single-plex comme précédemment décrit 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un animal meurt prématurément avant l’administration de FXIIa peptide inhibiteur ou de contrôle en raison d’une erreur technique (baisse soudaine de la pression artérielle au cours de la durée d’ischémie, avant l’ajout de la substance d’essai). Un animal a été exclu du groupe FXIIa inhibiteur car aucune lésion d’ischémie/reperfusion a été observée en raison de l’anatomie anormale de l’artère interventriculaire antérieure (LAD). Une grande partie du ventricule gauche, y compris l’apex, a été perfusée par l’artère circonflexe chez cet animal. Les animaux inclus dans l’analyse finale étaient n = 2 dans le groupe d’inhibiteur de peptide FXIIa bicyclique (poids moyen des 27,5 ± 2,5 kg) et n = 3 recevant un peptide inactif contrôle bicycliques (poids moyen des 29 ± 0,8 kg).
Vidéo d’imagerie à rayons x / angiographie coronaire du coeur cochon sert à visualiser la position de la sonde de pression et de décider où bloquer la dal (Figure 3 a). Figure 3 b montre la position du cathéter, bloquant la circulation sanguine distale à la deuxième branche diagonale. La comparaison des figures 3 a et 3 b autorise également une estimation dont la partie du myocarde fourni par LAD sera ischémique. À la fin de la période de ré-perfusion de 2 h, le cathéter PCI est réintroduit et gonflé à la même position que c’est au cours de l’ischémie. Bleu Evans est ensuite injecté par voie intraveineuse afin de déterminer avec précision l’AAR (Figure 5 a). Après l’excision du cœur, le ventricule gauche est découpé en coupes épaisses de 3 à 5 mm de l’apex jusqu'à la valve mitrale, perpendiculaire à l’axe longitudinal. AAR et l’ANR sont clairement délimités par le bleu Evans, taches sur les tranches. Zones d’échantillonnage AAR et de l’ANR sont indiquées dans la Figure 5 b.
L’AAR, exprimée en pourcentage de la LV, ne montre aucune différence statistiquement significative entre le groupe de FXIIa traité et le groupe témoin (Figure 6 a). La taille de l’infarctus (NIT/AAR) ne montre aucuns différences entre les groupes soit (utilisation non paramétrique de Mann-Whitney test p > 0,05, Figure 6 b). Ces données suggèrent qu’inhibiteur de la FXIIa seul, à la concentration utilisée et la durée d’application, pas pu protéger le cœur de myocardique je / blessure de R. Figure 6 et 6D montrent comment marquer les frontières de l’AAR et NIT afin de façon précise et reproductible mesurer les superficies respectives.
La stratégie d’échantillonnage de sang permet la libération de la troponine marqueur muscle cardiaque dommage-j’ai suivi au fil du temps. Il n’y a presque pas de différence après une heure d’ischémie avec la ligne de base tout en après que reperfusion il y a une augmentation continue au fil du temps, comme illustré à la Figure 7. Pour la troponine-I, différences entre les groupes n’étaient pas significatives dans ces expériences.
Figure 1 . Vue d’ensemble du montage expérimental. Calendrier schématique des étapes importantes dans le modèle de lésion d’ischémie/reperfusion myocardique. Visualisation de coronaire de base, à partir des temps de l’ischémie, surveillance des arythmies cardiaques et l’injection de la substance d’essai sont des étapes importantes dans l’expérience. L’utilisation du moment exact dans toutes les expériences assure la reproductibilité. Euthanasier l’animal et l’excision du cœur doit s’effectuer dans 15-20 min après la fin de la phase de reperfusion 2h. KCl : chlorure de potassium. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Chronologie des prélèvements sanguins et analyse. Points dans le temps pour les prélèvements sanguins sont indiqués, ainsi que du type d’anticoagulant utilisé. Des échantillons peuvent être prélevés selon l’expérience et les analytes à mesurer. ACTE : activé temps, BGA de coagulation : RT, analyse des gaz du sang : température de la pièce. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . L’angiographie coronaire. Radioscopique vue de (A) les coronaires gauche au départ, les flèches jaunes pointent vers la première et les deuxième diagonales branches, la flèche blanche pointe vers l’apex cardiaque (B) le garçon occlus ne montrant l’aucune zone de flux du ventricule gauche (VG), la flèche rouge pointe vers le PC J’ai cathéter (C) refermeture du garçon à la fin de la reperfusion avec le ballonnet de la sonde PCI puis réinséré au même endroit dans la dal comme pendant l’ischémie. CX : artère coronaire circonflexe LAD : gauche artère interventriculaire antérieure, MC : cathéter Millar, inséré dans le ventricule gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Diagramme schématique du prélèvement de. La chronologie exacte de la dissection du cœur et l’échantillonnage des différentes zones pour une analyse ultérieure. La chronologie démarre à 205 min après le début de l’ischémie, 20 min après la fin de l’expérimentation animale. Il est important pour l’incubation des coupes de tissus en TTC dans un délai maximum de 40 min après euthanasier l’animal. Échantillonnage de l’ANR, VIT et NIT est indiqué comme carrés blancs. L’incubation de l’AAR à 4 % de formaldéhyde permet une distinction claire entre NIT et VIT pour la détermination précise de la taille de l’infarctus. AAR : zone à risque, ANR : zone non en péril, LV : ventricule gauche, NIT : les tissus nécrosés ischémique, OTC : tissu-Tek, RV : ventricule droit, TTC : chlorure de triphényl tétrazolium, VIT : tissu ischémique viable. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . In situ différenciation entre la zone à risque (AAR) et zone non en péril ANR. (A) l’image représentative du coeur entier juste après sternotomie à la fin de l’expérience. (B) représentant photo montrant des tranches épaisses de ventricule gauche le 3-5 mm après dissection. AAR et l’ANR sont clairement définis, indiqué par les flèches jaunes, et la flèche blanche indique la zone de prélèvement ANR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Taille de l’ischémie et infarctus. (A) le pourcentage du poids de l’AAR du ventricule gauche (VG). B la superficie du pourcentage de la NIT de l’AAR. Image représentative A (C) le calcul de l’AAR. (D) une image représentative du calcul NIT. La flèche blanche indique la zone d’échantillonnage VIT et la flèche noire indique la zone de prélèvement d’échantillons de NIT. Données ont été calculées à l’aide de logiciels ImageJ. Les valeurs sont indiquées comme points pour chaque individu expérimentent avec indication de moyenne + Groupe de contrôle de SD., n = 3 et FXIIa inhibiteur traité groupe, n = 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 . Marqueur de dommages de muscle cardiaque. Troponine cardiaque-j’ai traité de concentration au fil du temps en pg/ml, du contrôle et inhibiteur de la FXIIa groupe. Sang a été prélevé la veine jugulaire dans des tubes plasma EDTA au départ, fin de l’ischémie et plusieurs points dans le temps au cours de la reperfusion et cardiaque troponine-j’ai mesuré par tableau de suspension simple-plex (Bio-Plex). Les données apparaissent comme points pour chaque individu expérimentent avec indication de moyenne + Groupe de contrôle de SD., n = 3 et le groupe FXIIa traité, n = 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myocardique je / blessure R a un effet significatif sur la taille de l’infarctus final qui se traduit directement dans le pronostic du patient après infarctus du myocarde aigu3. Comprendre la physiopathologie du myocarde j’ai / R blessure est la première étape pour réduire ou empêcher. Myocardique je / R blessure est une affection aiguë qui se produit directement après la reperfusion des vaisseaux obstrués. J’ai / blessure R conduit à l’activation de la réponse immunitaire innée et les lésions cellulaires se produisent sur le site de reperfusion et les tissus environnants20. Une étude récente a montré une amélioration dans les résultats neurologiques dans un modèle de rat de cerveau j’ai / blessure R lorsque traités par inhibiteur de FXIIa8. Toutefois, dans la présente étude pilote nous avons ne trouvé aucun effet de l’inhibiteur de FXIIa bicyclique sur myocardique je / blessure de R. L’inhibiteur de FXIIa utilisé est roman et sa pharmacocinétique chez les porcs ne sont pas encore connues. Par conséquent, l’absence observée de prise d’effet peut être dû par dosage inadéquat ou une application. Cela doit être abordée dans les études de suivi.
Normaliser un modèle animal est essentiel d’étudier en profondeur la physiopathologie du myocarde j’ai / blessure R et apporter des solutions adaptées dans des cliniques. Enquête sur la physiopathologie du myocarde j’ai / blessure R nécessite bon et représentatif de l’échantillonnage afin d’étudier les mécanismes cellulaires qui la sous-tend. Le thorax fermé porcin myocardique je / R blessure modèle fournit une méthode reproductible qui est proche de l’état clinique du patient et utile pour aider à comprendre les mécanismes cellulaires et test de nouvelles thérapeutiques nouvelles. Variantes du modèle actuel ont été décrits avant pour le ci-dessus mentionné fins14,17,18.
Notre protocole d’infarctus aigu du myocarde chez les porcs n’a pas besoin avant le traitement avec l’amiodarone comme décrit précédemment18,21. Massage du sinus carotidien nous permettant de réduire les arythmies cardiaques et un défibrillateur biphasique pour cardioconversion en cas de fibrillation ventriculaire. L’utilisation du massage du sinus carotidien est cliniquement connue pour influencer la fibrillation auriculaire22, mais jusqu'à présent il n’a pas été démontré pour prévenir ou retarder l’apparition d’une fibrillation ventriculaire à MI, chez l’homme ou dans les modèles de cochon. En outre, l’utilisation de sévoflurane contribue à réduire les arythmies ventriculaires ainsi que les taux de mortalité dans le modèle porcin de l’infarctus aigu du myocarde,23.
Pour assurer la reproductibilité et réduire le risque de thrombose pendant l’expérience, plusieurs doses d’héparine ont reçu une injection basé sur la mesure répétée de la Loi, plutôt que fixe des doses d’héparine tel que décrit par exemple par Koudstaal et al.,18. Une quantité contrôlée de l’administration d’héparine permet d’enquêter sur la cascade de coagulation dans le contexte d’I / blessure de R. Bleu Evans permet une détermination précise de l’AAR/LV. L’injection intraveineuse du bleu Evans, après que re-occlusion du garçon à l’emplacement exact durant l’induction ischémie sous contrôle radioscopique conduit à une coloration bleue de la cochon entier, y compris la partie non ischémique du coeur avec un effet minimal sur l’ANR myocarde et le système vasculaire. Bleu Evans est une substance cytotoxique connue24. Dans les expériences actuelles il est primordial d’assurer la viabilité de la couche de cellules endothéliales à l’ANR dans les vaisseaux du cœur afin de pouvoir pour utiliser ce titre individuel intra contrôler alors 100 mL bleu Evans était injecté systémique et dilué dans le sang en réduisant ses toxicité. Auparavant, dans un cadre similaire, 50 ml 2 % bleu Evans a été injecté directement dans les coronaires augmentant le risque de sa cytotoxicité à cardiaque cellules25. La prochaine étape importante a été de disséquer le coeur directement en tranches de 3 à 5 mm de l’apex jusqu'à la valvule mitrale (la position exacte de tous les animaux) et à l’aide de cette méthode pour faire un calcul précis de l’AAR en pourcentage du ventricule gauche.
La description actuelle de la méthode fournit des détails plus fins qui n’ont pas été décrits précédemment. Incubant TTC coloré section à 4 % de formaldéhyde pendant 24 heures prévoit une distinction claire entre viable (rouge) et tissus nécrosés (blanc), qui augmente enfin la reproductibilité de l’échantillonnage pour une coloration plus moléculaire. La stratégie d’échantillonnage de sang sur une période de 2 h de reperfusion permet la détection de molécules nouvellement exprimées dans les tout premiers stades (10 à 30 min) de reperfusion, mais aussi plus tard (60 et 120 min). Le sang correcte et prélèvement de tissus et le stockage sont également cruciaux pour l’analyse des marqueurs de cascade de plasma comme l’expression des protéines de complément et de la coagulation.
Le protocole actuel peut être modifié pour avoir un temps plus long de reperfusion, de quelques heures à quelques jours. Cela permet au chercheur d’enquêter sur les conséquences ultérieures d’I / blessure R sur le cœur et permet également les essais de nouveaux médicaments et évaluation de leurs effets. La limitation du protocole actuel est l’utilisation d’un cathéter de pression-astuce pour la mesure de la fonction cardiaque. Des données plus fiables sur la fonction cardiaque peuvent être obtenues par l’utilisation d’un système de mesure de boucle de pression-volume. En résumé la méthode actuelle offre détaillée des mesures importantes nécessaires pour améliorer la reproductibilité de la poitrine fermée porcine myocardique je / R blessure modèle lors de l’utilisation prévue pour le modèle est d’étudier les changements cellulaires et moléculaires dans le contexte de étude du myocarde j’ai / physiopathologie de blessure R ou étudier de nouvelles options thérapeutiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le professeur Christian Heinis qui fournissant l’inhibiteur de la FXIIa et le contrôle respectif. Nous remercions également Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler et Kay Nettelbeck de l’unité de chirurgie expérimentale, département de la recherche biomédicale, Université de Berne pour le support technique. Celine Guillod et Matthias Rausch du Département pour l’interventionnel, de Diagnostic et de radiologie pédiatrique, hôpital universitaire de Berne, Inselspital apporté un soutien avec des appareils à rayons x et des techniques. Ce projet a été financé par la Swiss National Science Foundation, projet n° 320030_156193. Nous tenons également à remercier M. Reto Haenni, de communication et marketing, hôpital universitaire de Berne, Inselspital pour l’enregistrement de notre expérience de la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N.
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N.
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
