눈 기구학 생체 외에서 거북이에 두개골 신경의 자극에 의해 측정

Summary

이 프로토콜에는 그들의 눈 운동의 운동학을 측정 하는 체 외에서 고립 된 거북이 머리 준비를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 두개골에서 뇌의 제거 후, 두개골 신경 척도 회전 눈의 동 공 크기에 변화를 전류로 자극 수 있습니다.

Abstract

동물 안락사는 후 그들의 조직 죽을 시작 합니다. 거북 특히 온 혈 척추 동물에 비교 될 때 그들의 조직의 더 긴 생존 시간 때문에 이점을 제공 합니다. 이 때문에, 신경 신호를 조사 하는 시간의 연장된 기간 및 그들의 대상 작업의 제어에 대 한 거북에 생체 외에서 실험을 수행할 수 있습니다. 고립 된 머리 준비를 사용 하 여, 거북, 눈 운동의 운동학 측정 그리고 전기 신호에 의해 그들의 변조 두개골 신경에 의해 수행. 두뇌는 두개골에서 제거 되었다, 후 그대로 두개골 신경, 해 부 머리에에서 배치 했다 안구의 움직임을 보정 하려면 짐 벌. 유리 전극은 두개골 신경에 연결 된 (oculomotor, trochlear, 그리고 abducens) 안구의 움직임을 연상 하는 전류와 자극. 우리는 적외선 비디오 추적 시스템 및 눈의 계량된 회전 안구의 움직임을 모니터링. 전류 펄스의 진폭, 주파수, 범위 그리고 기차 기간 응답에 미치는 영향을 관찰 하는 데 사용 했다. 준비는 뇌에서 분리 하기 때문에 근육 대상에가 하는 원심 성 통로 중앙 처리 감각 정보의 부재에서 신경 신호를 조사 하는 절연에서 시험 수 있다.

Introduction

빨간 귀 슬라이더 거북 Electrophysiological 실험에 사용 하기 위한 근거:

빨간 귀 슬라이더 거북 (Trachemys scripta 선 충), 세계 최악의 침략 종¹ 중 하나 간주 됩니다 하 고 생태계 문제 임을 나타낼 수 있습니다. 왜 빨간 귀 슬라이더 거북은 그래서 성공 하는 이유는 제대로 이해 하지만 일부 했기 때문일 수도 있습니다 그들의 관용 생리학과 신경 조직의 hypoxic 조건^{2,3,4에서 살아남을 수 있는 소유 물} . 실험 그들의 숫자를 위협 하지 않습니다에 대 한 최소한의 노력으로 electrophysiological 준비 남아 있을 수 있는 실행 가능한 만큼 18 시간^5,6연장된 기간 동안 그들을 사용 합니다. 혜택 또한 산소⁸의 낮은 레벨을 견딜 수 있는 대⁷, 같은 무척 추 동물 동물을 사용 하는 장....

Protocol

참고: 빨간 귀 슬라이더 거북, 둘 다 남성과 여성, 공급 업체 로부터 구입 했다. 거북이 따뜻한 동물 제품군 250 W 적외선 조명 아래 sunning 벽돌 제도 완비 두 60 갤런 통에에서 보관 되어 있었다. 환경 물 온도 22 ° c.에 14/10-h 명암 주기 유지 되었다 조명 오전 6시 켜져 있었고 오후 8시. 필터링 시스템 갖춘 탱크 매주 청소 했다 그리고 거북이 매일 광고 libitum 지 루 했다. 빨간 귀 슬라이더의 거북 그리고 다음 실험 절차 설명된 여기^32,33 의 모든 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 라파예트 대학에 의해 승인 했다.

1. 장비 설치

1. 터틀 벨의 솔루션을 준비 합니다. 이 순서 대로 증류수에 다음을 추가: 염화 나트륨 96.5 m m (58.44 g/mol), 2.6 m m (74.56 g/mol), 염화 칼륨 염화 마그네슘 2.0 m m (203.31 g/mol), 나트륨 중 탄산염 31.5 m m (84.01 g/mol), 포도 당 20.0 mM (180.16 g/mol), 집중 7.51, 및 염화 칼슘 4.0 m m (110.98 g/mol)에 pH를....

Results

그림 1 에서는 해 부를 설명 하는 비디오에서 촬영 한 이미지의 스틸. 이미지는 두뇌에서 절단 전에 신경의 일반적인 위치를 제공합니다.

그림 1: 시 신경 (nII), oculomotor 신경 (nIII), trochlear 신경 (nIV), 및 abducens 신경 (nVI)의 위치를 표시 해 부 비디오에서 캡처한 이미지의 스틸. (A) 이미지는 meninx의 제거 후 뇌의 레이블이 지정 된 영역. 규모를 화이트 바 = 10 m m. (B) 이미지 쇼 위치 nII, nII.......

Discussion

중요 한 단계:

이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 해 부와 transected 신경;의 생존 능력을 유지 하 게 하는 치료 2)과 일치 하는 크기의 두개골 신경 하 일관 된;에 흡입 전극 그리고 3) 눈의 회전의 적절 한 보정을 제공 하는 짐 벌에 머리의 배치.

문제 해결:

해 부도 전하실 수 있습니다, 하지만 그것에 게 몇 번을 완료 단계는 상대적으로 곧장 앞으로 될 것. 신경 응답 하지 않는 경우, 가장 큰 원인은 해 부의 실패 이다. 두뇌의 제거 하는 동안 최소한의 긴장과 압력 적용 되어야 한다 신경에 그들의 절단 하는 동안. 금속 수술 도구와 신경을 건드리지도 피해 야 한다 가능한 만큼, 그리고 그래서 유리 후크 및 플라스틱 집게 대체할 수 있는 금속 도구에 대 한 문제가 계속³⁴. 비록 거북이 조직 산소의 사용의 가.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
붉은귀슬라이더거북	Kons Scientific	Trachemys scripta elegans	L사이즈(갑각 길이 15-20cm)
염화나트륨	Sigma-Aldrich Co., LLC.	S5886
염화칼륨	Sigma-Aldrich Co. LLC.	P5405
마그네슘 합지	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M7304
중탄산나트륨	시그마-알드리치 주식회사 LLC.	S5761
포도당	시그마-알드리치 주식회사	C5767
농축 염산	Sigma-Aldrich Co. LLC.	H7020
염화칼슘	Sigma-Aldrich Co. LLC.	C7902
pH 측정기	Oakton	pH 6+
흡입 자극 전극	AM 시스템	573000	양극성 흡입 전극. 573000은 573050으로 대체되었습니다.
모세관 유리	A-M 시스템	626000	마이크로 필라멘트가 없는 단일 배럴 붕규산 모세관 유리, 길이 10cm, 외경 1.0mm, 내경 0.50mm
대체 흡입 자극 전극	AM 시스템	573050	양극 흡입 전극. 더 큰 직경의 모세관 유리 필요: 627000, 외경 1.2 mm, 내경 0.68 mm
스테레오스코프	Lieca	GZ7	배율 범위, 10x – 70x
광섬유 광원	Amscope	HL250-A	150W 광섬유 현미경 조명기 라이트 박스
Rongeurs	Carolina Biological Supply Company	625654	스테인리스 스틸, 직선 스프링, 5.25"
무딘 해부 프로브	Carolina Biological Supply Company	627405	Huber mall 프로브, 양단 프로브 및 시커, 6 "
Microscissors	Carolina Biological Supply Company	623555	아이리스 미세 해부 가위, 스테인리스 스틸, 0.5 "블레이드, 4.75 인치
길이 미세 집게	Sigma-Aldrich Co. LLC.	F6521	보석상 집게, dumont No. 5, inox 합금, 4.25"
곡선 집게	Sigma-Aldrich Co. LLC.	Z168696	미디엄 팁, 곡선 집게, 스테인리스 스틸, 4인치
메스 핸들	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S2896	메스 손잡이, 3번, 스테인리스 메
스 칼날	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S2771	메스 날, No. 11, 강철
단두대	Harvard Apparatus	73-1918	Kleine 단두대 유형 7575
주걱	시그마	Z648299	마이크로 스푼 및 주걱 계량 세트. 작은 주걱 사용: 5.9" 길이 x 0.07 인치 정사각형 끝이있는 직경 핸들 : 0.17 " x 1.3인치 긴, 다른 쪽 끝 라운드 : 0.17 " x 1.27인치 롱
훅	Autozone	98069	SureBilt 훅 및 픽 세트. 그라인더를 사용하여 갈고리의 날카로운 끝을 무디게 하여 동물의 입이 다치는 것을 방지하십시오.
95/5% O2/CO2	Airgas, Inc.	X02OX95C2003102	5% 이산화탄소 밸런스 산소 인증 표준 가스 혼합물, 크기 200 실린더, CGA-296
레귤레이터	Airgas, Inc.	Y11244D296-AG	1단 황동 0-100psi 분석 실린더 레귤레이터 CGA-296(니들 배출구 포함). 황동 조절 가능한 항공사 파이프 밸브를 사용하여 레귤레이터에 연결된 3/8", 내경, 비닐 항공사 튜브에서 3/16", 내경, 에어스톤 또는 유리 파스퇴르 피펫으로 가는 항공사 연결로 이동합니다.
조절 가능한 항공사 파이프 밸브	Doctors Foster and Smith	CD-12061	황동 밸브
강성 테이블	알 수 없음	수 없음	견고한 테이블 위에 놓인 자동 클레이브 도어. 9개의 5인치 직경 테니스 공은 테이블 상단 표면에서 진동을 차단합니다.
5인치 테니스 공	Petco Animal Supplies, Inc.	712868	Petco Jumbo Pet Tennis Ball: 공은 슬라이스되지 않고 오토클레이브 도어 아래쪽 부분의 통합 프레임 내에 고정됩니다.
대체 방진 테이블	Newport Corporation	INT1-36-6-N	강성 진동 제어 시스템, 무결성 1: 표면 치수, 3' x 6'
짐벌	ISI, International Scientific Instruments, Inc.	SUPER III-A 스캐닝 EM	5축 유센트릭 스테이지의 스테이지: X, Y, Z 선형 이동, ± 20mm, 0.1mm 정밀도; 회전, 수직, ± 10° 및 수평, ± 12.5°, 1.25° 정밀. 참고: 폐기 기기에서.
짐벌용 척	Unknown	제조	되지 않은 오래된 마이크로톰의 Chuck은 스캐닝 EM 스테이지
Alternative gimbal	ThorLabs, Inc.	나비 나사 조절기(MBT602/M)가 있는 3축 마이크로블록 스테이지에 장착된 MBT602/M이 있는 GN2/M: 고니오미터 상단 표면에서 12.7mm 위에 눈으로 거북이 머리를 고정하는 척 설계(회전 지점까지의 거리)비디오
기반 시선 추적 시스템	Arrington Research, Inc.	ViewPoint EyeTracker, PC-60	추적 방법: 어두운 동공에 의한 적외선 비디오; 흑백 카메라 (항목 BC02) : 30Hz, 640 x 480; 시스템 요구 사항: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; 가시 범위: 수평한 +/- 44°C; 수직 +/- 20°C;; 정확도 ~0.5°; 공간 해상도 ~0.15°; 동공 크기 해상도 ~0.03mm; 눈 데이터: X, Y의 시선 위치, 동공 높이 및 너비, 비틀림, 델타 시간, 총 시간 및 관심 영역(ROI); 실시간 통신(항목 0022): 데이터 파일에 코드를 표시하기 위한 8개의 TTL 입력 채널이 있는 4채널 아날로그출력
다중 위치 마그네틱베이스	Harbour Freight Tools	Pittsburg, 항목 #5645	마그네틱 홀더는 최대 12인치에 도달하고 45파운드의 마그네틱 풀을 생성합니다. 카메라를 배치하는 데 사용합니다. 막대 끝에 구멍을 뚫어 카메라를 장착합니다.
Micromanipulator	Kopf	900	흡입 전극 장착을 위한 5축 조작: X, Y, Z 선형 이동, 2축 회전
붐의 해부 범위	Lieca	GZ6	배율 범위, 6.7x – 40x
신경/근육 자극기	Astro-Med Grass Telefactor	Grass S88	듀얼 펄스 전압 자극기: 독립적으로 작동하거나 동기화하여 비절연 정전압 펄스(10mV - 150V)를 생성할 수 있는 2개의 출력 채널입니다. 펄스는 단일(10 μ 초에서 10초), 반복(0.01Hz에서 1KHz) 및 기차(1ms에서 10초) 및 TTL 입력 및 출력과 동기화됩니다. DB25 커넥터의 출력 채널을 통해 TTL 출력을 ViewPoint EyeTracker의 TTL 입력 채널로 보냅니다. 참고: Astro-Med Grass Telefactor는 더 이상 영업하지 않습니다.
전류 절연 장치	Astro-Med Grass Telefactor	PSIU6	전류 자극 절연 장치: S88에 의한 정전류를 제제에 안전하게 전달할 수 있습니다. PSIU6은 BNC 케이블을 통해 S88의 출력 채널 중 하나에 연결합니다. PSIU6의 승수 스위치를 통해 S88은 0.1 & 마이크로에 이르는 다양한 전류 진폭을 생성할 수 있습니다. A에서 15mA까지.
절연 기능이 있는 대체 신경/근육 자극기	AM Systems	2100	절연 펄스 자극기: 장치에는 일정한 전류를 생성하는 절연 장치가 내장되어 있습니다.