Denne protokol har til formål at opnå overflade teknik af pancreas Holme ved hjælp af heparin-indarbejdet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellem N– hydroxysuccinimide grupper af nanocoating og amine grupper af holmen cellens membran.
Celle overflade teknik kan beskytte implanterede celler fra værten immun angreb. Det kan også omforme cellular landskab for at forbedre graft funktion og overlevelse efter transplantation. Denne protokol har til formål at opnå overflade teknik af pancreas Holme ved hjælp af en ultratynde heparin-indarbejdet starPEG (Hep-PLØK) nanocoating. For at generere Hep-PIND nanocoating til pancreas islet overflade teknik, heparin succinimidyl succinat (Heparin-NHS) blev først syntetiseret af ændring af de carboxylat grupper ved hjælp af N-(3-dimethylamino propyl) –N’-ethyl carbodiimide hydrochlorid (EDC) og N– hydroxysuccinimide (NHS). Hep-PIND blandingen blev derefter dannet af crosslinking af amino ende-functionalized otte-bevæbnet starPEG (starPEG-(NH2)8) og Heparin-NHS. For Holmen overfladebehandling blev mus Holme isoleret via collagenase fordøjelse og gradient rensning ved hjælp af Histopaque. Isolerede øer blev derefter behandlet med is kold Hep-PIND løsning i 10 min at tillade kovalent binding mellem NHS og amine grupper af islet celle membran. Nanocoating med Hep-PIND pådrager minimal ændring til Holmen størrelse og volumen og heparinization af Holme med Hep-PIND kan også reducere instant blod-medieret inflammatorisk reaktion under islet transplantation. Denne “let-til-at vedtage” tilgang er mild nok til overflade teknik af levende celler uden at kompromittere cellernes levedygtighed. I betragtning af at heparin har vist bindende affinitet til flere cytokiner, Hep-PIND nanocoating også giver en åben platform, der giver mulighed for indarbejdelse af ubegrænset funktionelle biologiske mæglere og multi-lag overflader for levende celle overflade bioteknologi.
Den terapeutiske virkning af celle-baseret terapier er begrænset af lav celle fastholdelse og dårlig overlevelse1,2. For at forbedre resultatet af celle terapier, cellens overflade teknik via enzymatisk manipulation, har peptid konjugering, bioorthogonal kemi og fysisk indkapsling med biomaterialer været udbyttede3,4, 5,6,7,8,9,10. Den nuværende protokol har til formål at opnå overflade teknik af levende celler ved hjælp af en “let-til-at vedtage” metode ved at anvende en ultratynde heparin-indarbejdet starPEG (heparin-PLØK) nanocoating til cellens overflade. Overflade teknik af pancreas Holme blev præsenteret her som eksempel på grund af de heterogene karakter af Holme af Langerhanske og de nedsættende udfald af aktuelle kliniske islet transplantation.
Faktisk, kliniske islet transplantation er i øjeblikket udføres af direkte indsprøjtning af isolerede småøer i leverens portåren og denne procedure er kun tilgængelig for udvalgte patienter på grund af knapheden på donorer materialer og lav terapeutiske virkning 11. konventionelt, natriumalginat har været den mest almindeligt anvendte biomateriale til Holmen indkapsling og overflade ændring, selv om det er mindre end ideelt på grund af den kemisk ustabilitet af natriumalginat og inflammatoriske-relaterede fibrose12, 13. Desuden, i forhold til den fysiske størrelse af Holme svinger mellem 100-200 µm, natriumalginat-Holmen mikrokapsler er større, lige mellem 400 og 800 µm, der overstiger den fysiologiske spreder afstand af ilt. Conformal Holmen indkapsling, dvs., indkapsling Holme uden væsentlige ændringer af holmen volumen, blev derefter udviklet. Således aflejring af nanomembranes består af PIND, tetrafluorethylen, silicium membran eller multi-lag nanocoating (også kendt som “lag-på-lag” [LBL] teknik) er blevet rapporteret, hvilket resulterer i forbedrede in vitro- Holmen overlevelse14 ,15,16,17,18, selvom LBL tilgang ofte kræver omfattende Holme aflevering periode for deposition af flere lag, der kan kompromittere islet levedygtighed . Derudover rejser ustabilitet i nanomembranes, der bygger på elektrostatisk eller kovalent interaktioner mellem biomembrane lag eller hydrofobe interaktioner mellem nanomembranes og Holmen overflade også bekymringer9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
En anden begrænsende faktor, som besværliggør det terapeutiske resultat af intraportal Holmen transplantation er den instant blod-medieret inflammatorisk reaktion (IBMIR) forårsaget af direkte kontakt mellem implanterede Holme med blod, resulterer i trombocytaggregation, koagulation og negativ immun virkning eller uønskede cellulære aktivering9. For at løse disse problemer, var en ultra-tynd nanocoating sammensat af stjerne-formede polyethylen glycol (starPEG) forberedt på sin etablerede biokompatibilitet og alsidighed som islet boliger materiale. Heparin, et højt sulfateret glykosaminoglykan, var også indarbejdet i starPEG nanocoating for sine anti-inflammatoriske, antikoagulerende egenskaber og evne til at lette vascularization ved at rekruttere pro-angiogene vækstfaktorer22, 23.
I denne artikel vil vi vise en “let-til-at vedtage” tilgang til levende celle overflade teknik en heparin-indarbejdet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellem N– hydroxysuccinimide grupper af nanocoating og den amine grupper af pancreas islet overflade membran. Faktisk de amino grupper inden for cellemembraner er meget reaktive, og som et resultat, tidligere undersøgelser har rapporteret interaktioner mellem primære amino grupper med aktiveret N– hydroxysuccinimidyl (NHS) ester fysiologiske betingelser14 ,16,21. Derudover har omfattende forskning rapporteret, at indarbejdelsen af heparin, et højt sulfateret glykosaminoglykan og vigtig del af den ekstracellulære matrix, under islet indkapsling, kunne føre til forbedret efter transplantation revaskularisering og reduceret IBMIR22,23. I betragtning af biokompatibilitet af PIND og multivalent egenskaber af heparin brugte vi 8-bevæbnet PIND for maksimal heparin indlæses under fabrikation af nanocoating. Heparin blev ændret med -NHS, der efterfølgende ville reagere med -NH2 grupper på islet celle membran. Ved at aktivere den kovalente bånd dannelse mellem -NH2 (af cellemembranen) og -NHS af Hep-PEG, holmene ville være let “belagt” af heparin-indarbejdet PIND, som danner en nano-tynde lag (nanocoating) på den ydre overflade af den i bugspytkirtlen Holme.
Den nuværende fremgangsmåde er forskellig fra tidligere udgivne metoder, som også har valgt PIND som den store polymer til Holmen mikroindkapsling i denne pseudo-bioorthogonal kemi mellem -NHS (af nanocoating) og -NH2 islet celle membranen blev brugt. I betragtning af at stabilitet af holmen/celle belægning, især i et komplekst miljø som plasma, er afgørende for efter transplantation revaskularisering og overlevelse, dannelse mellem -NHS og -NH2 ville være mere stabil i forhold til hydrofobe interaktion mellem PIND og cellemembranen24, elektrostatiske interaktion9,15,24,25,26 eller biologiske koblingen mellem biotin streptavidin14.
Desuden, i modsætning til Holmen kræver belægning tilgang, der bygger på LBL tilgang med udvidet islet håndtering periode for multi-lag deposition14,16,25, den nuværende teknik også minimal forarbejdning og meget korte belægning periode af de isolerede småøer. Begge disse faktorer er afgørende for efter transplantation islet overlevelse, da Holme levedygtighed er ofte allerede kompromitteret følgende islet isolation på grund af beskadigede ECM under Enzymatisk nedbrydning. En begrænsning af den nuværende tilgang er imidlertid, at i modsætning til LBL, via som tykkelsen af den ydre belægning kan kontrolleres ved at øge eller reducere antallet af lag deposition, tykkelse af Hep-PIND nanocoating ikke kan skræddersys for tiden.
Desuden, på grund af den milde tilstand, hvor kemiske reaktion mellem -NHS og -NH2 finder sted, den nuværende fremgangsmåde er gældende for levende celle overflade teknik ikke begrænset til pancreas Holme, men de fleste celleterapi. Derudover overvejer at heparin er kendt for at interagere med en vifte af cytokiner og biologisk aktive molekyler, Hep-PIND nanocoating også præsenterer en åben platform, der har potentiale til indbygning af ubegrænset biologiske mæglere samt grænseflader til mere komplekse celle overflade teknik.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for den finansielle støtte af de nationale naturvidenskab midler i Kina (31770968) og Tianjin Research Program af ansøgningen Foundation og avanceret teknologi (17JCZDJC33400).
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |