Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila
Summary
Analisi quantitativa di assunzione di cibo con cibo tinto forniscono un robusto e ad alta velocità significa valutare motivazione d’alimentazione. Combinando l’analisi del consumo di cibo con termogenetica e schermi optogenetica è un approccio potente per studiare i circuiti neurali sottostanti l’appetito in adulto Drosophila melanogaster.
Abstract
Consumo alimentare è sotto il controllo stretto del cervello, che integra la condizione fisiologica, appetibilità e contenuto nutrizionale del cibo e problemi di comandi per avviare o interrompere l’alimentazione. Decifrare i processi che sottendono il processo decisionale di tempestiva e moderata alimentazione trasporta importanti implicazioni nella nostra comprensione dei disturbi fisiologici e psicologici legati al controllo dell’alimentazione. Metodi semplici, quantitativi e robusti sono necessari per misurare l’ingestione di cibo di animali dopo manipolazione sperimentale, come ad esempio forzatamente aumentando l’attività di determinati neuroni bersaglio. Qui, abbiamo introdotto analisi alimentazione colorante-etichettatura-based per facilitare lo studio Neurogenetica di controllo dell’alimentazione in adulti mosche della frutta. Esaminiamo saggi di alimentazione disponibile e quindi descrivere i nostri metodi passo-passo dal programma di installazione per l’analisi, che combinano termogenetica e optogenetica manipolazione dei neuroni controllo alimentazione motivazione con dosaggio di assunzione di cibo tingere-contrassegnati. Abbiamo anche discutere i vantaggi e le limitazioni dei nostri metodi, confrontati con altri saggi d’alimentazione, per aiutare i lettori a scegliere un’analisi appropriata.
Introduction
Quantificare la quantità di cibo ingerito è importante per valutare gli aspetti multipli di alimentazione comandi dal cervello in risposta alle esigenze interne (ad esempio Stati di fame) e fattori esterni (ad esempio, cibo di qualità e appetibilità)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. negli ultimi anni, gli sforzi di decifrare i substrati neurali di controllo dell’alimentazione in Drosophila conducono allo sviluppo di saggi multipli per quantificare la quantità di cibo ingerito o servire come un indicatore di alimentazione motivazione direttamente 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Il capillare dell’alimentatore (CAFE) dosaggio12,13 è stato sviluppato per misurare la quantità di consumo di liquidi alimentari in un microcapillary di vetro. Il dosaggio CAFE è altamente sensibile e riproducibile17 e semplifica la misurazione del consumo di cibo, soprattutto per la quantificazione di alimentazione a lungo termine18. Tuttavia, questo test richiede le mosche a salire fino alla punta della microcapillary e nutrire la testa in giù, che non è adatto per tutti i ceppi. Inoltre, perché le mosche da testare usando l’analisi CAFE hanno ad essere allevato su alimenti liquidi, l’effetto di queste condizioni il metabolismo status o la malnutrizione potenziale di allevamento rimane per essere determinata.
La risposta di estensione di proboscide (PER) dosaggio11,14 conta la frequenza delle risposte di estensione proboscide verso garbati tocchi di gocce di cibo. PER test che si è rivelato come un ottimo modo per valutare l’alimentazione motivazione della Mosca individuo e asini l’influenza dell’appetibilità e contenuto di cibo18,19. Tuttavia, non si tratta di una quantificazione diretta della quantità di assunzione.
Recentemente, è stato sviluppato un metodo semi-automatico, il saggio (MAFE)15, di alimentazione manuale. In MAFE, una singola Mosca immobilizzata è alimentata manualmente con un microcapillary contenenti alimenti. Dato che le risposte di estensione di proboscide e consumo alimentare possono essere controllati simultaneamente, MAFE è adatto per valutare i valori nutrizionali e gli effetti di manipolazione farmacologica. Tuttavia, immobilizzando una Mosca potrebbe compromettere le prestazioni comportamentali, compresa l’alimentazione.
Inoltre, volare proboscide e Activity Detector (FlyPAD)10 è stato sviluppato per quantificare automaticamente il comportamento alimentare. Utilizzando metodi di visione della macchina, FlyPAD registra interazioni fisiche tra un volo e cibo per quantificare la frequenza e la durata delle estensioni di proboscide come un indicatore di alimentazione motivazione. FlyPAD fornisce un approccio di alto-rendimento per monitorare i comportamenti d’alimentazione di una Mosca liberi di muoversi, anche se la sensibilità e la robustezza di questo sistema rimane per essere ulteriormente confermata da più studi12.
Strategie d’etichettatura sono frequentemente utilizzate per stimare l’ingestione di cibo in mosche. È comune per etichettare il cibo con traccianti chimici e, dopo la poppata, misurare la quantità di tracciante ingerito per calcolare la quantità di assunzione di cibo. Traccianti radioattivi16,17,20,21,22,23,24,25 consentono la rilevazione attraverso la cuticola senza omogeneizzazione delle mosche. Questo metodo fornisce notevolmente bassa variabilità e alta sensibilità18ed è fattibile per studio a lungo termine dell’ingestione di cibo. Tuttavia, la disponibilità di radioisotopi utilizzabile e diversi tassi di assorbimento ed escrezione devono tener conto quando si lavora con questo test.
Etichettatura e rintracciabilità assunzione di cibo con colori atossici alimentari è un più sicuro e semplice alternativa2,3,26,27,28. Mosche sono omogeneizzati dopo l’alimentazione con alimenti contenenti coloranti solubili e non assorbibili, e la quantità del colorante ingerito più tardi è quantificata utilizzando un spettrofotometro3,24,28,29 . La strategia di etichettatura è facile da eseguire e fornisce alta efficienza, ma con un avvertimento. Il volume dell’ingestione di cibo stimato da tintura ingerita è più piccolo di volume effettivo perché escrezione inizia già a 15 min dopo mosche avviare l’alimentazione17. Inoltre, il test valuta l’ingestione di cibo in genere entro un periodo di 60 minuti, che è adatto solo per indagine di alimentazione a breve termine comportamento24,28. Inoltre, molteplici fattori interni ed esterni, come genotipo17, genere17, accoppiato stato17, allevamento densità30, ritmo circadiano31,32e cibo di qualità3 , 8 , 16, influenza l’ingestione di cibo. Pertanto, la durata di alimentazione potrebbe essere necessario essere regolata in base alle specifiche condizioni sperimentali. Oltre a facilitare la quantificazione dell’ingestione di cibo, coloranti alimentari sono utilizzati anche per valutare il cibo scelte2,19,27e di visualizzare il menisco in un microcapillary in CAFE dosaggio12.
Qui, presentiamo una protocollo combinato manipolazione dell’attività neuronale con approccio d’etichettatura della tintura. Questa strategia si è dimostrata utile nel nostro studio Neurogenetica il controllo dell’alimentazione in mosche adulte frutta24. Il metodo di giudizio visivo permette per una rapida stima del consumo di cibo; Pertanto, è utile per lo screening attraverso un gran numero di ceppi in modo tempestivo. I candidati dalla schermata vengono poi analizzati in dettaglio utilizzando un metodo colorimetrico per fornire obiettivo e quantificazione precisa in studio aggiuntivo.
Oltre a saggi d’alimentazione, abbiamo inoltre descrivono i termogenetica27,33,34,35 e optogenetica36 metodi del forzatamente attivazione di neuroni bersaglio in drosofila. Per attivare i neuroni da termogenetica operazione è semplice e conveniente con Drosophila Transient Receptor potenziali Ankyrin 1 (dTRPA1), che è un canale cationico temperatura e tensione-gated che aumenta l’eccitabilità neuronale quando l’ambiente temperatura superiore a 23 ° C33,37; Tuttavia, gli esperimenti su animali ad alte temperature potrebbe produrre effetti negativi sul comportamento. Un altro approccio efficace per attivare i neuroni in Drosophila utilizza optogenetica con CsChrimson36, che è una variante rosso-spostato di channelrhodopsin che aumenta l’eccitabilità dei neuroni quando esposto alla luce. Optogenetica offre risoluzione temporale superiore e minore dispersione a comportamenti di thermogenetics. Combinando la misurazione quantitativa dell’ingestione di cibo con la manipolazione dell’attività neuronale rappresenta un efficace approccio per lo studio dei meccanismi neurali di alimentazione.
Descriviamo in dettaglio la preparazione della camera di alimentazione e le mosche da testare. Utilizzando Taotie-Gal4 mosche come un modello24, descriviamo i neuroni d’attivazione di thermogenetics e optogenetica. Due saggi di quantificazione del consumo alimentare con cibo tingere-contrassegnati sono anche descritti nel protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto si concentra sul processo tecnico di saggi d’alimentazione colorante-etichettatura del consumo alimentare nel contesto di termogenetica e optogenetica attivazione per manipolare i neuroni di controllo alimentazione. Questo protocollo semplice e affidabile vi aiuterà a chiarire la funzione dei neuroni del candidato nel controllo, per misurare la preferenza dell’alimento di mosche e per identificare nuovi giocatori nei circuiti di controllo alimentazione tramite schermi genetici basati su alimentazione<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla base nazionale ricerca programma della Cina (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 e 9163210042), Accademia cinese delle scienze (CAS) (GJHZ201302 e QYZDY-SSW-SMC015), Bill e Melinda Gates Programma Foundation (OPP1119434) e 100-talenti di CAS a Y. Zhu.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
