定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化
Summary
着色食品と定量的食物摂取の試金を提供、高スループット意味摂食意欲を評価します。Thermogenetic と食料消費分析を組み合わせて光の画面は大人で食欲の神経回路を調査するための強力なアプローチとキイロショウジョウバエ。
Abstract
食糧消費は、生理学的状態、嗜好、食品、および開始または給餌を停止するコマンドを発行の栄養の内容を統合する脳の厳格な管理下です。タイムリーかつ適度な送り制御に関連する生理学的な心理的な障害の理解に運ぶ主要な含意を餌の意思決定の基礎となるプロセスを解読します。単純な定量的、かつ堅牢な方法特定のターゲットのニューロンの活動を強制的に増やすなどの実験操作の後動物の食物摂取を測定する必要があります。大人のショウジョウバエの送り制御の遺伝研究を促進する色素ラベルに基づく摂食アッセイを紹介しました。利用可能な供給アッセイを確認して、thermogenetic を組み合わせて分析し、色素ラベル食品摂取量試金の摂食刺激を制御する神経細胞の光遺伝学的操作のセットアップから順を追って手法を述べる。利点と読者適切な試金を選択するために、他の餌アッセイと比較して, 本手法の限界についても述べる。
Introduction
食品摂取量の定量化は餌 (飢餓状態) などで必要な内部および外部要因 (食品の品質および食味) など1,への応答では、脳によるコントロールのさまざまな側面を評価するために重要です2,3,4,5,6,7,8,9. 近年、ショウジョウバエの送り制御の神経基盤を解読の努力は直接摂取食品の量を定量化したりモチベーションを餌の指標として複数のアッセイの開発につながる10,11,12,13,14,15,16。
キャピラリー フィーダー (カフェ) アッセイ12,13ガラス マイクロキャピ ラリーで液状の食品の消費量を測定するため開発されました。カフェ アッセイで高感度・再現性の高い17食品の消費、特に長期的な供給18を定量化するための測定が簡単になります。ただし、このアッセイは、マイクロキャピ ラリーの先端に登るとフィード逆さまにすべての株に適しているないハエを必要です。さらに、カフェ アッセイを用いたテストするハエは、流動食に飼育する必要がある、ために、これら代謝状態または潜在的な栄養失調の飼育の効果は決定するのまま。
テング拡張応答 (PER) アッセイ11,14食品滴の優しいタッチに向けたテング拡張機能の応答回数をカウントします。評価するための優れた方法として証明されるアッセイごと食味の影響や食品18,19のコンテンツ個々 のフライとロバの動機を供給します。しかし、摂取量の直接定量ではないです。
最近では、半自動式方法、餌アッセイ (アジア パシフィック)15マニュアルが開発されました。アジア パシフィック、1 つの固定されたフライは食品を含むマイクロキャピ ラリーを手動で供給されます。テング拡張応答と食物摂取を同時に監視できる、アジア パシフィックは栄養価と薬理学的操作の影響の評価に適しています。ただし、フライを固定可能性がありますパフォーマンスに悪影響その行動、摂食を含みます。
さらに、テングを飛ぶ、アクティビティ検出器 (FlyPAD)10が自動的に摂食行動を定量化する開発されました。マシン ビジョン メソッドを使用して、FlyPAD はフライと動機を餌の指標として頻度とテングの拡張の期間を定量化する食品の物理的な相互作用を記録します。感度とこのシステムの頑健性はより確認されてさらに残っているが、可動式のハエの摂食を監視する高スループット方法研究12FlyPAD を提供します。
ラベリング戦略は、ハエの食物摂取を推定するよく使用されます。化学トレーサーを食品にラベルを付けるし、授乳後摂取したトレーサーの食物摂取量を計算するの量を測定するが一般的です。放射性トレーサー16,17,20,21,22,23,24,25キューティクルによる検出を可能にします。なく、ハエの均質化。このメソッドは、著しく低い変動と高感度18を提供し、食品の摂取量の長期調査の実行可能なです。ただし、使用可能な放射性同位元素の可用性と吸光度と排泄量必要があります考慮するこのアッセイを操作するとき。
ラベリングと非毒性食品の色と食品摂取量をトレースは、安全でシンプルな代替の2,の3,26,27,28です。ハエは水溶性と非吸収性の染料を含む食物と一緒に授乳後均質化し、摂取の色素の量は、分光光度計3,24,28,29 を用いて定量化は後.ラベリングの戦略を実行するはたやすいし、高効率を提供しますが、注意。摂取の色素から推定した食物摂取量が排泄開始 15 分早ければハエ17に送り込むので実際の量よりも小さい。さらに、アッセイは、短期的な摂食行動24,28の調査のためにだけ適している 60 分期間内通常食品を摂取を評価します。さらに、遺伝子型17、男女17など、複数の内部および外部要因交配状態17, 飼育密度30、概日リズム31,32、および食品の品質の3,8,16、影響食品の摂取量。したがって、給餌期間は、特定実験条件に応じて調整する必要があります。食品の色は食物摂取量の定量化を容易にするほか、食品の選択肢2,19,27を評価し、カフェ アッセイ12マイクロキャピ ラリーのメニスカスを視覚化するも使用されます。
色素標識による神経活動の結合のプロトコル操作を紹介します。この戦略は、大人の果実ハエ24の送り制御に関する私たちの遺伝研究に有用な証明されています。得点方法は、食品消費量の簡易推定したがって、タイムリーに系統の数が多いを通じて検診に便利です。画面からの候補者は、目的と追加調査で正確な定量を提供する比色法を用いて詳細に分析しています。
餌の試金のほか thermogenetic27,33,34,35と光36メソッドを強制的にターゲットショウジョウバエのニューロンを活性化について述べる。Thermogenetic、ニューロンをアクティブ化する操作が簡単・便利にショウジョウバエ過渡受容体潜在的アンキリン 1 (dTRPA1)、神経の興奮性を増加、温度と電位依存性陽イオン チャネルであるとき周囲23 ° C33,37; 上記の温度上昇します。しかし、高温動物をテスト動作に悪影響を及ぼすを生成可能性があります。ショウジョウバエのニューロンをアクティブにする別の効果的なアプローチが使っている光遺伝学 CsChrimson36ライトに露出されたときのニューロンの興奮性を増加チャネルロドプシンのレッドシフト バリアントであります。研究では、高い時間分解能と thermogenetics よりも動作にあまり障害を提供しています。神経活動の操作と食物摂取の定量的測定を組み合わせること供給の神経機構を研究するための効果的な方法を表します。
テストする授乳室とハエの準備について詳細に述べる。餮 Gal4ハエを使用すると、モデル24thermogenetics、光遺伝学による活性化ニューロンをについて説明します。染め分類された食糧と食糧消費の数量の 2 つの試金はプロトコルでも説明されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポートは、thermogenetic のコンテキストにおける食料消費の染料ラベル供給の試金の技術的なプロセスに焦点を当てと神経細胞を操作する光遺伝学的活性化制御を供給します。このシンプルで信頼性の高いプロトコルは、候補送り制御、ハエ、嗜好を測定し、供給ベース遺伝的画面24を介して給電制御回路の新規プレーヤーを識別するニューロンの働きを解明するのに役…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は基本的な研究プログラムの中国国家 (2012CB825504)、国家自然科学基金、中国の (91232720 および 9163210042)、中国アカデミー科学 (CAS) の (GJHZ201302 および QYZDY SSW SMC015) 部分で支えられましたビルとメリンダ ・ ゲイツY. 朱の ca 財団 (OPP1119434)、および 100 の才能プログラム。
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
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