Сочетая анализов количественных пищи и насильно активации нейронов для изучения аппетит у дрозофилы
Summary
Анализов количественных пищи с окрашенных пищей обеспечивают надежную и высок объём средств для оценки кормления мотивации. Сочетание пробирного потребления продуктов питания с thermogenetic и optogenetic экраны представляет собой мощный подход к расследованию нейронных цепей лежащие в основе аппетит у взрослых Drosophila melanogaster.
Abstract
Потребление продуктов питания находится под жестким контролем головного мозга, которая интегрирует физиологического статуса, вкусовых и питательных содержание продовольствия, и вопросы команд, чтобы запустить или остановить кормления. Расшифровка процессы, лежащие в основе принятия решений своевременного и умеренное питание несет серьезные последствия в нашем понимании физиологических и психологических расстройств, связанных с кормления контроля. Простой, количественные и надежные методы необходимы для измерения при приеме внутрь пищи животных после экспериментальных манипуляций, например насильно увеличение деятельности некоторых нейронов целевой. Здесь мы ввели на основе маркировки краска кормления анализов для облегчения neurogenetic изучения кормления контроля взрослых плодовых мушек. Мы обзор доступных кормления анализов, а затем описать методы нашей шаг за шагом, от установки до анализа, который объединить thermogenetic и optogenetic манипуляции нейронов, контролируя кормления мотивации с assay впускного пищевой краситель меченых. Мы также обсудить преимущества и недостатки методов нашей работы, по сравнению с другими кормления анализов, чтобы помочь читателям выбрать соответствующий assay.
Introduction
Количественная оценка количество пищи, организм имеет важное значение для оценки нескольких аспектов кормления контроля мозга в ответ на внутренние потребности (например, голод государств) и внешних факторов (например, качество пищи и вкусовых качеств)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. в последние годы, усилия по расшифровке нейронных субстратов кормления контроля у дрозофилы привести к развитию несколько анализов напрямую подсчитать количество пищи, организм или служить индикатором питания мотивации 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Капиллярные фидер (CAFE) пробирного12,13 был разработан для измерения объема потребления жидких пищевых продуктов в микрокапиллярной стекла. КАФЕ является весьма чувствительным и воспроизводимые17 и упрощает измерения потребления продуктов питания, особенно для количественной оценки долгосрочного питания18. Однако этот assay требует мух подняться на кончик микрокапиллярной и кормить вверх вниз, который подходит не для всех штаммов. Кроме того потому что мух проверяется с помощью кафе assay должны воспитываться на жидких пищевых продуктов, воздействие этих воспитания условия на метаболизм статус или потенциального недоедания остается быть обусловленным.
Хоботок расширение ответ (PER) пробирного11,14 подсчитывает частоту Хоботок расширение ответы к нежные прикосновения капель пищи. В Пробирной зарекомендовал себя как отличный способ оценить кормления мотивации отдельных полетов и ослов влияние вкусовых качеств и содержание питания18,19. Однако это не прямой количественной оценки объема потребления.
Недавно полуавтоматический метод, ручной подачей пробы (СДЕЛАВ)15, была разработана. В СДЕЛАВ один иммобилизованных Муха вручную подается с микрокапиллярной, содержащих продуктов питания. Учитывая, что Хоботок расширение ответы и потребление продовольствия могут контролироваться одновременно, СДЕЛАВ подходит для оценки питательной ценности и последствия манипуляции фармакологическом. Однако иммобилизирующие Муха может отрицательно сказаться поведенческих производительности, включая питание.
Кроме того, летать Хоботок и деятельность детектор (FlyPAD)10 был разработан, чтобы автоматически подсчитать кормления поведение. Используя методы видения машины, FlyPAD записи физических взаимодействий между летать и продовольствия для количественного определения частоты и продолжительности Хоботок расширений в качестве показателя кормления мотивации. FlyPAD обеспечивает что высок объём подход для мониторинга питания поведения-перемещение летать, хотя чувствительность и надежность этой системы остается далее подтверждается более исследования12.
Обозначая стратегии часто используются для оценки употребления пищи в мух. Она является общей для обозначения продуктов питания с химических индикаторов и, после кормления, измерить количество попадает трассировщик для вычисления количества потребляемой пищи. Радиоактивные Трейсеры16,17,20,21,,2223,24,25 позволяют для обнаружения через кутикулу без гомогенизации мух. Этот метод обеспечивает удивительно низкой изменчивости и высокая чувствительность18и возможно для долгосрочного исследования потребления пищи. Однако наличие использования радиоизотопов и различных темпов поглощения и выведения должны приниматься во внимание при работе с этот assay.
Маркировки и отслеживания пищи с нетоксичные красители это безопаснее и проще альтернатива2,3,26,27,28. Мухи гомогенизированных после кормления с пищей, содержащих красители растворяется и не рассасывающиеся, и количество попадает красителя позднее количественно с помощью спектрофотометра3,24,28,29 . Обозначая стратегия легко выполнить и обеспечивает высокую эффективность, но с оговоркой. Объем потребления пищи, по оценкам от краска попадает меньше, чем фактический объем, поскольку выведение начинается 15 мин в кратчайшие сроки после того, как мухи начать кормить17. Кроме того анализ оценивает проглатывание пищи обычно в течение 60-мин, который подходит только для расследования краткосрочных кормления поведение24,28. Кроме того несколько внутренних и внешних факторов, таких как генотип17, пол17, вязка государства17, воспитание плотность30, суточный ритм31,32и качества продовольствия3 , 8 , 16, влияние пищи. Таким образом продолжительность кормления может потребоваться корректироваться с учетом конкретных экспериментальных условиях. Помимо облегчения количественной оценки потребления пищи, пищевые красители используются также для оценки продовольственной Выбор2,19,27и визуализировать мениска в микрокапиллярной в кафе пробирного12.
Здесь мы представляем протокол комбинированные манипуляции нейронной активности с подходом, краситель маркировки. Эта стратегия была оказался полезным в нашей neurogenetic исследование кормления контроля взрослых плодовых мушек24. Метод визуального скоринг позволяет для быстрой оценки потребления продовольствия; Таким образом это полезно для проверки через большое количество штаммов своевременно. Кандидаты от экрана затем анализируются подробно колориметрическим методом предоставление объективной и точной количественной оценки дополнительного исследования.
Помимо питания анализов мы также описать thermogenetic27,33,34,35 и optogenetic36 методы насильственно активации нейронов целевой у дрозофилы. Чтобы активировать нейроны, thermogenetic операция является простым и удобным с дрозофилы переходных рецептор потенциальных Анкирины 1 (dTRPA1), который является воротами температуры и напряжения катиона канал, который увеличивает возбудимость нейронов когда окружающего Температура поднимается выше 23 ° C33,37; Однако тестирование животных при высоких температурах может произвести неблагоприятное воздействие на поведение. Еще один эффективный подход для активации нейронов в дрозофилы используется Оптогенетика с CsChrimson36, который является разновидностью смещается красный channelrhodopsin, которая увеличивает возбудимость нейронов при воздействии света. Оптогенетика предлагает выше временное разрешение и меньшей нарушения поведения, чем thermogenetics. Сочетая количественное измерение потребляемой пищи с манипуляции нейронной активности представляет эффективный подход для изучения нейронных механизмов кормления.
Мы подробно описать подготовка питание камеры и мух для проверки. С помощью Taotie-Gal4 летит как модель24, мы описываем активирующих нейронов, thermogenetics и Оптогенетика. Два анализов количественной оценки потребления продуктов питания с пищевой краситель меченых также описаны в протоколе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий доклад сосредоточен на технический процесс маркировки краска кормления анализов потребления продовольствия в контексте thermogenetic и optogenetic активации манипулировать нейронов контроля питания. Это простой и надежный протокол поможет уточнить функции нейронов кандидата в кормл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали национальные базовые исследования программа Китая (2012CB825504), национальные естественные науки фонд Китая (91232720 и 9163210042), Китайской академии наук (CAS) (GJHZ201302 и QYZDY-Южный-SMC015), Билл и Мелинда Гейтс Фонд (OPP1119434) и 100-таланты программа CAS для Y. Чжу.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
