बैसिलस सबटिलिस के एकल-कक्ष Microfluidic विश्लेषण
Summary
हम एक उदाहरण के रूप में बैसिलस सबटिलिस का उपयोग कर व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिका वंश के microfluidic विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि सूक्ष्म नियंत्रणीय और समान विकास की स्थिति के तहत सेल पीढ़ियों के सैकड़ों के प्रेक्षण की अनुमति से माइक्रोबायोलॉजी में पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों की कमियों पर काबू ।
Abstract
Microfluidic प्रौद्योगिकी सूक्ष्म जीव विज्ञान में पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए सीमाओं के कई पर काबू पा । थोक संस्कृति के तरीकों के विपरीत, यह एकल सेल संकल्प और लंबे समय अवलोकन पीढ़ियों के सैकड़ों फैले बार प्रदान करता है; agarose पैड आधारित माइक्रोस्कोपी के विपरीत, यह एक समान विकास की स्थिति है कि कसकर नियंत्रित किया जा सकता है । क्योंकि विकास माध्यम के निरंतर प्रवाह को स्थानीय रासायनिक कोशिका वृद्धि और चयापचय की वजह से वातावरण में अप्रत्याशित बदलाव से एक microfluidic डिवाइस में कोशिकाओं को अलग, जीन अभिव्यक्ति में प्रामाणिक परिवर्तन और के जवाब में सेल विकास विशिष्ट उत्तेजनाओं और अधिक आत्मविश्वास से मनाया जा सकता है । बैसिलस सबटिलिस यहां एक मॉडल बैक्टीरियल प्रजातियों के रूप में प्रयोग किया जाता है एक “मां मशीन” सेलुलर विश्लेषण के लिए प्रकार विधि का प्रदर्शन । हम कैसे निर्माण और एक microfluidic उपकरण पाइपलाइन को दिखाने के लिए, यह कोशिकाओं के साथ लोड, सूक्ष्म इमेजिंग आरंभ, और एक वृद्धि माध्यम से दूसरे में स्विचन द्वारा एक उत्तेजना के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश । एक stress-उत्तरदाई रिपोर्टर इस विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो डेटा का प्रकार प्रकट करने के लिए एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है । हम भी संक्षेप में इस तरह के प्रयोगों के अंय प्रकार के लिए इस विधि के अनुप्रयोगों, जैसे बैक्टीरियल sporulation के विश्लेषण के रूप में चर्चा ।
Introduction
पृथ्वी पर जीवन का सबसे हड़ताली सुविधाओं में से एक अपने महान लचीलापन और विविधता है । आणविक जीवविज्ञान का एक केंद्रीय लक्ष्य तर्क है जिसके द्वारा कोशिकाओं को जीन और प्रोटीन का उपयोग करने के लिए पर्यावरण की स्थिति की एक विस्तृत विविधता के तहत उनके विकास और फिटनेस को अधिकतम समझ है । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, वैज्ञानिकों को विश्वास कैसे व्यक्तिगत कोशिकाओं के बढ़ने, विभाजन का पालन करने में सक्षम होना चाहिए, और शर्तों का एक दिया सेट के तहत अपने जीन एक्सप्रेस, टिप्पण कैसे कोशिकाओं को अपने वातावरण में बाद में परिवर्तन का जवाब । हालांकि, माइक्रोबायोलॉजी में पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीके तकनीकी सीमाएं हैं जो प्रश्नों के प्रकारों को प्रभावित करती हैं जिन्हें संबोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, बल्क संस्कृति आधारित विश्लेषण वर्षों में बहुत उपयोगी है, फिर भी वे केवल जनसंख्या-स्तर के डेटा की पेशकश करते हैं जो सार्थक सेल-टू-सेल रूपांतरों या कुल जनसंख्या में कोशिकाओं की छोटी उप-आबादी के व्यवहार को मुखौटा कर सकते हैं. एकल सेल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के आधार पर रहने वाले बैक्टीरिया का विश्लेषण एकल सेल व्यवहार प्रकट लेकिन यह भी तकनीकी रूप से सीमित कर रहे हैं । बैक्टीरिया आम तौर पर विकास के माध्यम से युक्त agarose पैड पर मैटीरियल हैं, लेकिन सेल विकास और विभाजन सूक्ष्म दृश्य भीड़ और उपलब्ध पोषक तत्वों के बस कुछ सेल चक्र के बाद घट जाती है, काफी प्रेक्षण समय1सीमित, 2. इसके अलावा, पोषक तत्वों के स्थानीय घट और चयापचय प्रतिफल के सहवर्ती buildup सेल विकास के कारण लगातार तरीके कि उपाय या भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है में स्थानीय सेल विकास के माहौल बदल रहे हैं । agarose पैड का उपयोग कर इस तरह के पर्यावरण परिवर्तन स्थिर राज्य व्यवहार या विकास की स्थिति में विशिष्ट परिवर्तन के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक चुनौती मुद्रा3.
Microfluidic प्रौद्योगिकी, जिसमें एक तरल माध्यम लगातार microfabricated उपकरणों के माध्यम से प्रवाहित है, क्लासिक प्रयोगात्मक सीमाओं के लिए एक समाधान प्रदान करता है । एक microfluidic डिवाइस लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए स्थिति में व्यक्तिगत कोशिकाओं को रख सकते हैं, जबकि विकास मध्यम के प्रवाह लगातार ताजा पोषक तत्वों के साथ कोशिकाओं को प्रदान करता है और दूर चयापचय शोधकार्य और अतिरिक्त कोशिकाओं को धो देता है, जिससे एक अत्यधिक समान वृद्धि का निर्माण पर्यावरण. निरंतर वृद्धि की स्थिति के तहत, सेल व्यवहार पर्यावरण कारकों के प्रभाव से अलगाव में देखा जा सकता है, कोशिकाओं के आंतरिक तर्क की एक बेरोक देखने की अनुमति । द्रव प्रवाह के रूप में कोशिकाओं के साथ भीड़ बनने से microfluidic डिवाइस रोकता है, दसियों या पीढ़ियों के सैकड़ों के लिए एकल कोशिका वंश का अवलोकन संभव हो जाता है4,5. इस तरह के लंबे समय अवलोकन बार अंयथा undetectable दीर्घकालिक या दुर्लभ सेल व्यवहार का पता लगाने की अनुमति । अंत में, माध्यम की संरचना है कि उपकरण के माध्यम से बहती है पर बदला जा सकता है, की अनुमति कोशिकाओं के रूप में मनाया जाएगा के रूप में वे एक तनाव की शुरुआत या एक विशेष यौगिक के हटाने या निकालने के लिए प्रतिक्रिया ।
Microfluidics पहले से ही कई महत्वपूर्ण आवेदनों का आनंद लिया है । उदाहरण के लिए, यह ऊतक में इस्तेमाल किया गया है, अंग-, या शरीर पर एक चिप उपकरणों, जिसमें कई मानव कोशिका प्रकार के सह रहे हैं-एक vivo हालत में अनुकरण करने के लिए प्रसंस्कृत6; microstructured वातावरण में निमेटोड आंदोलन के अध्ययन के लिए7; बैक्टीरियल फिल्म के बीच बातचीत की जांच करने के लिए (जैसे, 8); और encapsulation और कोशिकाओं या रसायनों के छोटे संस्करणों के हेरफेर के लिए (उदा, 9) । Microfluidic उपकरणों को भी सूक्ष्म जीव विज्ञान के क्षेत्र में तेजी से लोकप्रिय हो गए है (उत्कृष्ट समीक्षा के लिए, 10 और 11देखें), विशेष रूप से उनके शारीरिक और प्रवाह के गुणों को अच्छी तरह से प्राकृतिक माइक्रोबियल niches12से मिलान कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, microfluidics हाल ही में ठीक सेल विकास और विभाजन13,14,15को मापने के रूप में ऐसे प्रयोजनों के लिए विज्ञानियों द्वारा नियोजित किया गया है, रोगज़नक़ आंदोलन16का विश्लेषण, निरीक्षण कोरम संवेदन17 और शारीरिक संक्रमण18, और प्रोटीन के लिए19गिनती, कई अंय उदाहरणों के बीच । विधि यहां प्रस्तुत विशेष रूप से एक जीवाणु कोशिका वंश के विश्लेषण के बजाय उपभेदों या प्रजातियों के संयोजन के लिए बनाया गया है । microfluidic डिवाइस यहां का प्रदर्शन किया “मां मशीन” डिजाइन4, जिसमें कोशिकाओं को एक microfluidic खाई के भीतर एक बंद अंत और एक खुले अंत के साथ एकल फ़ाइल बड़े हो रहे है की एक भिंनता का इस्तेमाल; कोशिका वृद्धि और विभाजन के तरल प्रवाह में संतति कोशिकाओं को खुले छोर से ऊपर और बाहर धकेलता है । हमारे विश्लेषण आमतौर पर केवल “मां” सेल कि खाई के बंद अंत में सीमित है पर ध्यान केंद्रित । हम पिछले प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर एक उंनति के रूप में इस विधि पर विचार agarose पैड पर सेल स्थिरीकरण के रूप में एकल सेल विश्लेषणात्मक तकनीक, आधारित । जबकि बी सबटिलिस यहां एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है, विधि भी अंय जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू है (ई कोलाई एक और आम मॉडल है; विभिंन कोशिका आकार या morphologies के साथ कुछ प्रजातियों के नए उपकरणों के निर्माण की आवश्यकता हो सकती है विभिंन आयामों के साथ) । फ्लोरोसेंट पत्रकारों के उपयोग के लिए कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन कल्पना आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय प्रजातियों के उपयोग की आवश्यकता है; हालांकि, सेल विकास और आकृति विज्ञान के विश्लेषण भी फ्लोरोसेंट मार्करों के बिना संभव हो रहे हैं ।
वर्तमान प्रोटोकॉल सिलिकॉन photolithography का उपयोग कर मास्टर, जो बड़े पैमाने पर किया गया है कहीं और5वर्णित के निर्माण की प्रक्रिया शामिल नहीं है; परास्नातक microfabrication सुविधाओं से भी आसानी से आउटसोर्स किया जा सकता है । यह एक प्रबलित सिलिकॉन मास्टर से एक PDMS डिवाइस की ढलाई भी शामिल है; कवर ग्लास का एक टुकड़ा करने के लिए डिवाइस संबंध; मध्यम स्विचन परमिट करने के लिए चुटकी वाल्व सहित microfluidic प्रवेश और आउटलेट नलसाजी, कोडांतरण; passivating डिवाइस, बैक्टीरियल कोशिकाओं की तैयारी, और बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ डिवाइस लोड हो रहा है; डिवाइस के लिए नलसाजी संलग्न और कोशिकाओं equilibrating; और इमेजिंग के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर डिवाइस लोड हो रहा है । क्योंकि कई अलग छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर उपकरण के लिए कल्पना और ब्याज के विभिंन डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है4,5, उदाहरण छवियों को दिखाया जाता है, लेकिन छवि पर कब्जा तरीके इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस microfluidics प्रोटोकॉल में लचीला है कि कई कदम के लिए एक विशेष प्रजातियों या तनाव या एक विशिष्ट प्रयोजन के लिए इसके उपयोग का अनुकूलन संशोधित किया जा सकता है । दरअसल, इस प्रोटोकॉल में हम मूल “मां मशीन” अवधारणा म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना GM018568 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया । इस प्रोटोकॉल भाग में नेनो सिस्टम (सीएनएस), राष्ट्रीय नैनो समंवित बुनियादी सुविधा नेटवर्क (NNCI) है, जो NSF पुरस्कार no १५४१९५९ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के एक सदस्य के लिए केंद्र में किया गया था । सीएनएस हार्वर्ड यूनिवर्सिटी का हिस्सा है । बहुत धंयवाद थॉमस नॉर्मन और नातान यहोवा के कारण में उनके काम के लिए कर रहे है और निर्माण मास्टर यहां दिखाया उपकरणों के लिए इस्तेमाल किया टेंपलेट और उपकरण के मूल संस्करण बनाने में । हम भी अपने बहुमूल्य सहयोगी सलाह के लिए जोहन Paulsson धंयवाद और उनकी सलाह के लिए अपनी प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद और बैक्टीरियल microfluidic उपकरणों के लिए जारी सुधार ।
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
