Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis
Summary
Presentiamo un metodo per l’analisi di microfluidica di lignaggi di singola cellula batterica utilizzando Bacillus subtilis come esempio. Il metodo sormonta le imperfezioni dei tradizionali metodi analitici in microbiologia, consentendo l’osservazione di centinaia di generazioni di cellulari in condizioni di crescita uniforme e ben controllabile.
Abstract
Tecnologia microfluidica supera molte delle limitazioni ai tradizionali metodi analitici in microbiologia. A differenza dei metodi di cultura di massa, offre risoluzione cella singola e lunga osservazione volte spanning centinaia di generazioni; a differenza dell’agarosi basati su pad microscopia, ha condizioni di crescita uniforme che possono essere strettamente controllate. Perché il flusso continuo di crescita medio consente di isolare le cellule in un dispositivo microfluidico da imprevedibili variazioni nell’ambiente chimico locale causato dalla crescita delle cellule e del metabolismo, autentici cambiamenti nell’espressione genica e la crescita delle cellule in risposta a stimoli specifici possono essere osservati con maggiore sicurezza. Bacillus subtilis è utilizzato qui come una specie batterica di modello per dimostrare una “macchina madre”-digitare metodo per analisi cellulare. Vi mostriamo come costruire e scandagliare un dispositivo microfluidico, caricarlo con cellule, avviare la formazione immagine microscopica e di esporre le cellule ad uno stimolo di commutazione da una coltura a altra. Un reporter lo stress-sensible a reagire è utilizzato come esempio per rivelare il tipo di dati che possono essere ottenuti da questo metodo. Inoltre brevemente discutiamo ulteriori applicazioni di questo metodo per altre tipologie di esperimenti, quali l’analisi di sporulazione batterica.
Introduction
Una delle caratteristiche più sorprendenti della vita sulla terra è la sua ottima resilienza e varietà. Un obiettivo centrale della biologia molecolare è di capire la logica con cui le cellule usano geni e proteine per massimizzare la loro crescita e fitness sotto un’ampia varietà di condizioni ambientali. Per raggiungere questo obiettivo, gli scienziati devono essere in grado di osservare con fiducia come crescono le singole celle, dividono ed esprimono loro geni sotto un dato insieme di condizioni, notando come le cellule rispondono alle successive modifiche nel loro ambiente. Tuttavia, i tradizionali metodi analitici in microbiologia hanno limitazioni tecniche che interessano i tipi di domande che possono essere affrontate. Ad esempio, analisi basati sulla cultura di massa sono stati molto utili nel corso degli anni, ma offrono solo dati a livello di popolazione che possono mascherare significative variazioni di cellula–cellula o i comportamenti di più piccole sottopopolazioni di cellule nella popolazione totale. Analisi unicellulare di batteri viventi basati su microscopia chiara rivelano unicellulare comportamento ma anche tecnicamente limitati. Batteri in genere sono immobilizzati su agarosi pastiglie contenenti terreno di coltura, ma folle crescita e divisione di cella la vista al microscopio e impoverisce i nutrienti disponibili dopo pochi cicli cellulari, sostanzialmente limitando il tempo di osservazione1, 2. Inoltre, lo svuotamento locale di sostanze nutritive e la concomitante formazione di sottoprodotti metabolici a causa della crescita delle cellule sono costantemente l’ambiente di crescita delle cellule locali in modi che sono difficili da misurare o prevedere. Tali cambiamenti ambientali usando agarosio rilievi rappresentano una sfida agli studi dei comportamenti stazionario o delle risposte cellulari agli specifici cambiamenti nella crescita condizioni3.
Tecnologia microfluidica, in cui un mezzo liquido è attraversato continuamente i dispositivi microfabbricati, offre una soluzione al classici limiti sperimentali. Un dispositivo microfluidico può mantenere singole celle in posizione per microscopia di cellule vive, mentre il flusso del mezzo di crescita costantemente cellule fornisce i nutrienti fresche e lava via i sottoprodotti metabolici e cellule in eccesso, creando così una crescita altamente uniforme ambiente. In condizioni di costante crescita, i comportamenti delle cellule possono essere osservati in isolamento dall’influenza di fattori ambientali, permettendo una vista ai confini della logica interna delle cellule. Come il flusso del fluido impedisce che il dispositivo microfluidico diventando affollato con le cellule, osservazione dei lignaggi di singola cellula per decine o centinaia di generazioni diventa possibile4,5. Tali tempi di osservazione lungo consentono la rilevazione di comportamenti non altrimenti rilevabili rari o a lungo termine delle cellule. Infine, la composizione del mezzo che attraversa il dispositivo può essere modificato a volontà, permettendo che le cellule devono essere rispettate come rispondono all’insorgenza di uno stress o per l’introduzione o la rimozione di un particolare composto.
Microfluidica ha già goduto di un numero di importanti applicazioni. Per esempio, è stato utilizzato in tessuto, organo o dispositivi di corpo-on-a-chip, in cui più tipi di cellule umane sono co-coltivati per simulare un in vivo condizione6; per lo studio del movimento del nematode in ambienti microstrutturata7; per esaminare le interazioni tra i biofilm batterici (ad es., 8); e per l’incapsulamento e la manipolazione di piccoli volumi di cellule o sostanze chimiche (ad es., 9). Dispositivi microfluidici sono diventati sempre più popolari nel campo della microbiologia (per recensioni eccellenti, Vedi 10 e 11), soprattutto come loro fisico e proprietà di flusso sono ben abbinati a nicchie microbiche naturali12. Per esempio, microfluidica è stato recentemente impiegato da microbiologi per tali scopi come misura precisamente cella crescita e divisione13,14,15, analizzando patogeno movimento16, monitoraggio di quorum sensing17 e transizioni fisiologico18e per la proteina contando19, fra molti altri esempi. Il metodo presentato qui è specificamente progettato per l’analisi dei lignaggi di singola cellula batterica piuttosto che combinazioni di specie o ceppi. Il dispositivo microfluidico dimostrato qui utilizza una variante di “macchina madre” design4, in cui le cellule sono coltivate file singolo all’interno di una trincea di microfluidica con un’estremità chiusa e una aperta; divisione e crescita delle cellule spinge le cellule progenie e fuori l’estremità aperta nel flusso del fluido. Le nostre analisi in genere concentrano solo sulla cella “madre” che si limita all’estremità chiusa della trincea. Consideriamo questo metodo come un avanzamento sopra precedente leggeri basato su microscopia unicellulare tecniche analitiche, quali immobilizzazione delle cellule su agarosio pastiglie. Mentre b. subtilis è utilizzato come un modello di qui, il metodo è applicabile ad altre specie batteriche (Escherichia coli è un altro modello comune; alcune specie con celle di diverse dimensioni o morfologie possono richiedere la realizzazione di nuovi dispositivi con dimensioni diverse). L’uso di reporter fluorescenti per contrassegnare le celle e di visualizzare i cambiamenti nell’espressione genica richiede l’uso di specie geneticamente trattabili; Tuttavia, l’analisi della crescita delle cellule e la morfologia sono possibili anche senza marcatori fluorescenti.
Il presente protocollo esclude il processo di fabbricare il maestro di silicio mediante fotolitografia, che è stato ampiamente descritta altrove5; Master può anche essere facilmente in outsourcing da strutture di microfabbricazione. Esso comprende lo stampaggio di un dispositivo PDMS da un maestro di silicone rinforzato; incollaggio al dispositivo di un pezzo di vetro di copertura; montaggio l’entrata di microfluidica e tubature di scarico, compreso pizzico valvole per consentire la commutazione medie; passivante del dispositivo, la preparazione delle cellule batteriche e caricamento della periferica con cellule batteriche; Collegare l’impianto idraulico al dispositivo ed equilibrare le cellule; e caricamento della periferica su un microscopio a fluorescenza per l’imaging. Perché molti diversi immagine acquisizione ed elaborazione software strumenti possono essere utilizzati per visualizzare e analizzare dati diversi di interesse4,5, immagini di esempio sono mostrate, ma metodi di acquisizione delle immagini non sono inclusi nel presente protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo di microfluidica è flessibile in quanto molti dei passaggi possono essere modificate per ottimizzarne l’uso con una particolare specie o ceppo o per uno scopo specifico. In questo protocollo, infatti, abbiamo fatto modifiche al concetto “macchina madre” originale4 per ottimizzarne l’uso con Bacillus subtilis. Spesso, le trincee in cui le cellule sono confinate costituiscono una caratteristica di monostrato, considerando che in questo protocollo usiamo trincee di due-str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal National Institutes of Health, sotto GM018568. Questo protocollo è stato effettuato in parte al centro per sistemi su scala nanometrica (CNS), un membro della nazionale nanotecnologia coordinato infrastruttura rete (NNCI), che è sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio NSF n. 1541959. CNS è parte dell’Università di Harvard. Molte grazie sono dovuti Thomas Norman e Nathan Lord, per il loro lavoro nella ideazione e realizzazione del modello master utilizzato per i dispositivi mostrati qui e nella creazione della versione originale dell’apparato. Inoltre ringraziamo Johan Paulsson per i suoi preziosi consigli collaborativo e ringraziare i membri del suo laboratorio per i loro consigli e continue migliorie agli apparati di microfluidica batterica.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
