Medición de la deformabilidad y la heterogeneidad de glóbulos rojos en sangre por Ektacytometry
Summary
Aquí presentamos técnicas para medir la deformabilidad del glóbulo rojo y la heterogeneidad celular por ektacytometry. Estas técnicas son aplicables a las investigaciones generales de la deformabilidad del glóbulo rojo y las investigaciones específicas de enfermedades de la sangre caracterizadas por la presencia de rígidos y deformables eritrocitos en la circulación, tales como anemia de células falciformes.
Abstract
Disminución de eritrocitos deformabilidad es característica de varios trastornos. En algunos casos, el grado de deformabilidad defectuoso puede predecir la severidad de la enfermedad o la aparición de complicaciones graves. Ektacytometry utiliza láser viscometry difracción para medir la deformabilidad de eritrocitos sometidos a tensión de esquileo creciente o un gradiente osmótico en un valor constante de esfuerzo de corte aplicado. Sin embargo, las mediciones directas de la deformabilidad son difíciles de interpretar al medir sangre heterogénea que se caracteriza por la presencia de eritrocitos rígidos y deformables. Esto es debido a la incapacidad de las células rígidas para alinear correctamente en respuesta a la tensión de esquileo y los resultados en un patrón de difracción distorsionado caracterizado por una disminución exagerada de deformabilidad aparente. La medición del grado de distorsión proporciona un indicador de la heterogeneidad de los eritrocitos en sangre. En la anemia de células falciformes, esto se correlaciona con el porcentaje de células rígidas, que refleja la concentración de hemoglobina y la composición de la hemoglobina de los eritrocitos. Además de medir la deformabilidad, osmótico gradiente ektacytometry proporciona información acerca de la fragilidad osmótica y el estado de hidratación de los eritrocitos. Estos parámetros también reflejan la composición de la hemoglobina de los glóbulos rojos de pacientes de la célula de hoz. Ektacytometry mide deformabilidad en las poblaciones de glóbulos rojos y no, por lo tanto, proporciona información sobre la deformabilidad o propiedades mecánicas de los eritrocitos individuales. Cueste lo que cueste, el objetivo de las técnicas descritas en este documento es proporcionar un método conveniente y confiable para medir la deformabilidad y la heterogeneidad celular de la sangre. Estas técnicas pueden ser útiles para el monitoreo de cambios temporales, así como la progresión de la enfermedad y respuesta a la intervención terapéutica en algunos trastornos. Anemia de células falciformes es un ejemplo bien caracterizado. Otros posibles trastornos donde las mediciones de la deformabilidad del glóbulo rojo y heterogeneidad son de interés incluyen el almacenamiento de la sangre, diabetes, infección por Plasmodium , deficiencia de hierro y las anemias hemolíticas por defectos de membrana.
Introduction
Ektacytometry proporciona una medida conveniente de la deformabilidad de eritrocitos en respuesta a alteraciones en la tensión de esquileo (medida en pascales (Pa)) o suspendiendo la osmolalidad del medio. Correspondientes parámetros de deformabilidad del glóbulo rojo son el índice de alargamiento máximo (máximo de IE), una medida de la máxima deformabilidad de un glóbulo rojo en respuesta a la creciente tensión de esquileo y tensión de esquileo ½ (SS ½), el esfuerzo cortante requerido para lograr el máximo de la mitad deformabilidad. 1 ektacytometry gradiente osmótico tiene varios parámetros informativos. Estos incluyen el índice de alargamiento mínimo (Min IE), una medida de la relación superficie a volumen y la osmolalidad en el que ocurre (O minutos), que es una medida de la fragilidad osmótica. Max de la IE y la osmolalidad en el que ocurre (O (IE máx.)) proporcionan información sobre membrana flexibilidad y célula superficie. Medio elongación máxima en el brazo hipertónico del gradiente osmótico está representada por EI hyper. Hiper de la IE y la osmolalidad en el que se produce, O hiperactivo, proporcionan información sobre la viscosidad intracelular de la célula roja que está determinada por la concentración de hemoglobina. 2 , 3 medición de deformabilidad en sangre heterogéneo se complica por el hecho de que células rígidas, tales como glóbulos rojos falciformes, no se alinean correctamente con la dirección del flujo como células deformables en respuesta al aumento de tensión de esquileo. En lugar de producir una imagen de difracción elíptica característica, células rígidas producen un patrón esférico que se traduce en un patrón de difracción en forma de diamante cuando overlaid de la elipse producida por las células deformables. 4 , 5 , 6 el patrón esférico se ha demostrado para corresponder a las células irreversiblemente falciformes realizando ektacytometry fracciones aisladas de células después de la centrifugación de la densidad. 6 el cálculo de índice de elongación incluye las medidas de los ejes largo y corto de la elipse; forma de diamante por lo tanto produce una aparente disminución en la elongación aumentando la anchura del eje corto. 7 se ha demostrado previamente que el grado de distorsión del patrón de difracción se correlaciona con el porcentaje de la hemoglobina drepanocítica (HbS) y el porcentaje de células falciformes en la sangre de pacientes con anemia de células falciformes. 5 el grado de distorsión del patrón de difracción se puede obtener por análisis matemáticos complejos. 8 también se puede obtener mediante el ajuste de la abertura de la abertura de la cámara en el ektacytometer o el nivel gris del software de instalación para modificar la altura del patrón de difracción. 5 sin embargo, detalles sobre cómo ajustar el nivel de gris no están bien definidos y la apertura de la cámara no es fácilmente accesible en la última generación de la ektacytometer disponible en el mercado. Para evitar estos problemas, el aumento de la cámara fácilmente accesible puede utilizarse para ajustar la altura del patrón de difracción. 9 utiliza este método para estimar la heterogeneidad celular, el grado de distorsión del patrón de difracción puede ser correlacionado con el porcentaje de hemoglobina fetal en la sangre de los pacientes con anemia de células falciformes. 10 varios parámetros ektacytometry gradiente osmótico también se correlacionan con el porcentaje de fetal o hemoglobina en la sangre de pacientes con anemia de célula de hoz. Correlaciones de distorsión de difracción patrón probablemente reflejan la contribución de la composición de la hemoglobina para el porcentaje de células rígidos, indeformable. De interés adicional, el perfil entero ektacytometry osmótico de gradiente sufre cambios bifásicos que corresponden al porcentaje de células densas en circulación durante crisis de células falciformes. 11
Ektacytometry es además útil en el estudio de varios otros trastornos. Ektacytometry gradiente osmótico es de diagnóstico para los trastornos de membrana heredados del glóbulo rojo, como la esferocitosis hereditaria, eliptocitosis hereditaria y pyropoikilocytosis hereditaria. 3 , 12 , 13 , 14 deformabilidad disminuido ocurre en la deficiencia de hierro. 15 caracterización de la “lesión de almacenamiento” de sangre ha empleado ektacytometry y futuros estudios investigando tanto la naturaleza de la lesión y las intervenciones para prevenir su formación durante el almacenamiento de sangre en bancos son susceptibles de beneficiarse de la técnicas presentadas aquí. 16 deformabilidad de eritrocitos disminución también se ha correlacionado con enfermedad microvascular en la diabetes. 17 estudios recientes enlazan a hiperglucemia, las concentraciones de ascorbato del glóbulo rojo y la fragilidad osmótica sugieren que estos factores pueden ser importantes en el desarrollo de la enfermedad microvascular. 18 Ektacytometry están actualmente realizando estudios para investigar esta hipótesis (Parrow y Levine, datos no publicados). Infección palúdica de la etapa de sangre es otra vía interesante de las investigaciones de deformabilidad del glóbulo rojo. Deformabilidad celular de falciparum del Plasmodium infectan eritrocitos disminuye dramáticamente durante las 48 horas de maduración intracelular del parásito desde anillo a etapa de esquizonte. La evidencia indica que esta disminución de la deformabilidad se invierte sobre la maduración del parásito. La reversión coincide con lanzamiento de eritrocitos infectados en la circulación. Disminución de la deformabilidad es probablemente mediada por proteínas de Plasmodium que promoción el secuestro de los eritrocitos. 19 estos estudios representan una pequeña muestra de condiciones clínicamente importantes donde medición deformabilidad del eritrocito y parámetros de gradiente osmóticos son relevantes. Existen varias otras áreas de estudio.
Técnicas alternativas para la medición de la deformabilidad del glóbulo rojo incluyen pinzas ópticas (también conocidas como trampas de láser) que utilizan las propiedades físicas de los fotones para estirar las células rojas en una o más direcciones. 20 esta técnica tiene la ventaja de medir la deformabilidad de los eritrocitos individuales, pero cierta incertidumbre en la calibración de fuerza ha producido una considerable variabilidad en los estudios 21 y análisis de datos pueden ser mano de obra intensiva a menos que automatizado. 22 la aspiración de una micropipeta, que utiliza presión negativa para aspirar un eritrocito en una micropipeta, también se ha utilizado para medir la deformabilidad de los glóbulos rojos. 7 , 23 mediciones múltiples, tales como la presión necesaria para aspirar el glóbulo rojo, son posibles con cada medida de definir diversas características de la célula roja. 23 microscopía de fuerza atómica es una técnica de alta resolución que mide la rigidez de la membrana mediante la cuantificación de la desviación de la viga del laser como un indicador de la desviación del voladizo a lo largo de la superficie de un glóbulo rojo. 24 estas técnicas proporcionan información sobre los eritrocitos, no se adaptan fácilmente para medir los cambios en las poblaciones de glóbulos rojos y, en general, requieren considerables conocimientos técnicos.
El deseo individual y las poblaciones de células al mismo tiempo ha llevado a avances en la automatización y el desarrollo de la microfluídica y métodos basados en la matriz. Como ektacytometry, rheoscopy medidas de deformabilidad en función del esfuerzo cortante pero se adquieren imágenes directamente a través de microscopio. 25 para mayor análisis de rendimiento, proyección de imagen de célula automatizada se ha empleado para producir distribuciones de deformabilidad con el rheoscope. 26 heterogeneidad celular puede cuantificarse por este método si se dispone de datos de un sujeto de control sano. 27 técnicas de microfluídica también permiten alto rendimiento análisis de células individuales; múltiples diseños utilizando adaptaciones de filtración, analizadores de tránsito celular28 ,29 , que mide el tiempo requerido para un flujo de eritrocitos a través de un microporo y alternativas que miden la presión requerida para el tránsito del eritrocito más bien de tiempo 30 han sido desarrollados. Otra plataforma de alto rendimiento análisis de células individuales es el única célula microcámara array chip, que tiene la ventaja adicional de permitir la caracterización basada en fluorescencia aguas abajo de las células. 31 aunque cada una de estas técnicas es potencialmente útil y puede ser superior para aplicaciones particulares, las ventajas comparativas de ektacytometry incluye sensibilidad, facilidad de uso y precisión. 32 ektacytometers disponibles en el mercado de última generación también posee considerable versatilidad en el número de ensayos que se pueden realizar.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ektacytometry técnicas descritas son sencillas y bien automatizados, asegurando resultados válidos y reproducibles. Sin embargo, existen algunos pasos críticos. Control de la temperatura adecuada de la sangre es importante. Almacenamiento a temperatura ambiente durante más de ocho horas puede afectar a SS ½ valores. 34 asegurar que la temperatura de la máquina es estable a 37 ° C también es importante, como el medio de suspensión es temperatura dependiente. Sangre se debe oxigenar comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros de los institutos nacionales de la Diabetes, digestivo y enfermedades del riñón y el National Heart, Lung and Blood Institute de los institutos nacionales de salud. Las opiniones aquí expresadas son responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
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