Måling af Deformability og roede blodlegemer heterogenitet i blodet ved Ektacytometry

Summary

Her præsenterer vi teknikker til at måle roede blodlegemer deformability og cellulære heterogenitet af ektacytometry. Disse teknikker anvendes til generelle undersøgelser af roede blodlegemer deformability og specifikke undersøgelser af blodsygdomme karakteriseret ved tilstedeværelsen af både stive og deformerbare røde blodlegemer i cirkulation, såsom seglcelleanæmi.

Abstract

Nedsat rød celle deformability er karakteristisk for flere lidelser. I nogle tilfælde kan omfanget af defekte deformability forudsige sværhedsgraden af sygdommen eller forekomsten af alvorlige komplikationer. Ektacytometry bruger laser diffraktion viscometry for at måle deformability af røde blodlegemer enten stigende shear stress eller en osmotisk gradient på en konstant værdi på anvendt shear stress. Direkte deformability målinger er imidlertid vanskeligt at fortolke når måling heterogene blod, der er karakteriseret ved tilstedeværelsen af både stive og deformerbare røde blodlegemer. Dette er på grund af stive celler manglende evne til korrekt tilpasse svar på shear stress og resultater i en forvrænget diffraktionsmønster præget af en overdreven fald i tilsyneladende deformability. Måling af graden af forvrængning giver en indikator af heterogenitet af erytrocytter i blodet. I seglcelleanæmi, er dette korreleret med den procentdel af stive celler, som afspejler den hæmoglobin koncentration og hæmoglobin sammensætning af erytrocytter. Ud over måling deformability, giver osmotisk gradient ektacytometry oplysninger om den osmotiske skrøbelighed og hydrering status af erytrocytter. Disse parametre også afspejle hæmoglobin sammensætningen af røde blodlegemer fra seglcelle patienter. Ektacytometry måler deformability i populationer af røde blodlegemer og ikke, derfor giver oplysninger om deformability eller mekaniske egenskaber af individuelle erytrocytter. Uanset, er målet med de teknikker, der er beskrevet heri at give en bekvem og pålidelig metode til måling af deformability og cellulære heterogenitet af blod. Disse teknikker kan være nyttig til overvågning af tidsmæssige ændringer, samt sygdomsprogression og respons til terapeutisk intervention i flere lidelser. Seglcelle anæmi er en vel karakteriseret eksempel. Andre potentielle forstyrrelser, hvor målinger af roede blodlegemer deformability og/eller heterogenitet er af interesse omfatter opbevaring af blodet, diabetes, Plasmodium infektion, jernmangel, og hæmolytisk Anæmier skyldes membran defekter.

Introduction

Ektacytometry giver en praktisk foranstaltning af roede blodlegemer deformability som svar på ændringer i shear stress (målt i PA (Pa)) eller suspension medium osmolalitet. Relevante parametre af roede blodlegemer deformability omfatter det maksimale brudforlængelse indeks (EI Max), et mål for den maksimale deformability af røde blodlegemer som reaktion på stigende shear stress, og shear stress ½ (SS ½), shear stress kræves for at opnå halvdelen maksimal deformability. ¹ osmotisk gradient ektacytometry har flere informative parametre. Disse omfatter brudforlængelse indeks minimum (EI Min), en foranstaltning af overflade-til-volumen forhold og osmolalitet som det sker (O Min), som er en foranstaltning af osmotisk skrøbelighed. EI Max og osmolalitet som det sker (O (EI Max)) indeholder oplysninger om membran fleksibilitet og celle areal. Halv maksimal brudforlængelse i den hypertonisk arm af den osmotiske gradient er repræsenteret ved EI hyper. EI hyper og osmolalitet hvor den forekommer, O hyper, give oplysninger om den intracellulære viskositet af de roede blodlegemer, som bestemmes af hæmoglobin koncentration. ^{2 , 3} måling deformability i heterogene blod kompliceres af det faktum, at stive celler, såsom sickled røde blodlegemer, ikke korrekt tilpasse med retning af flow som deformerbare celler som reaktion på stigende shear stress. I stedet for at producere en karakteristisk elliptisk diffraktion billede, producerer stive celler en sfærisk mønster, hvilket resulterer i en diamant-formede diffraktionsmønster når overlejret på ellipsen produceret af deformerbare celler. ^{4 , 5 , 6} den sfæriske mønster har vist sig at svare til uigenkaldeligt sickled celler ved at udføre ektacytometry på isolerede fraktioner af celler efter tæthed centrifugering. ⁶ brudforlængelse indeks beregningen omfatter foranstaltninger både lange og korte akse af ellipse; en diamantform derfor producerer et tydeligt fald i brudforlængelse ved at øge bredden på den korte akse. ⁷ det er tidligere påvist, graden af diffraktion mønster forvrængning er korreleret med både procentdelen af segl hæmoglobin (HB) og procentdelen af sickled celler i blodet fra patienter med seglcelle anæmi. ⁵ graden af diffraktion mønster forvrængning kan opnås ved komplekse matematiske analyser. ⁸ det kan også opnås ved at justere åbning af kamera blænden på ektacytometer eller den grå niveau af tilpasningssoftware at ændre diffraktion mønster højde. ⁵ dog oplysninger om, hvordan man justere det grå niveau er ikke veldefineret og kamera blænde er ikke umiddelbart tilgængelig på den nyeste generation af de kommercielt tilgængelige ektacytometer. For at omgå disse problemer, kan lettilgængeligt kamera gevinst bruges til at justere diffraktion mønster højder. ⁹ ved hjælp af denne metode til at anslå cellulære heterogenitet, kan graden af diffraktion mønster forvrængning være korreleret med procentdelen af føtalt hæmoglobin i blodet hos patienter med seglcelle anæmi. ¹⁰ flere osmotisk gradient ektacytometry parametre er ligeledes korreleret med procentdelen af føtal eller seglcelle hæmoglobin i blodet fra patienter med seglcelle anæmi. Diffraktion mønster forvrængning korrelationer sandsynligvis afspejle bidrag af hæmoglobin sammensætning til procentdelen af stive, ikke-deformerbare celler. Af yderligere interesse gennemgår hele osmotisk gradient ektacytometry profil bifasisk ændringer, der svarer til procentdelen af tætte celler i omsætning under seglcelle krise. ¹¹

Ektacytometry er ligeledes nyttig i studiet af flere andre lidelser. Osmotisk gradient ektacytometry er diagnostisk for nedarvede rød celle membran lidelser, såsom arvelige spherocytosis, arvelig elliptocytosis og arvelige pyropoikilocytosis. ^{3 , 12 , 13 , 14} nedsat deformability opstår i jernmangel. ¹⁵ karakterisering af “opbevaring læsion” blod har ansat ektacytometry og fremtidige studier undersøger både arten af læsionen og tiltag til at forhindre dens dannelse under opbevaring af krænges blod er tilbøjelige til at drage fordel af den teknikker præsenteret her. ¹⁶ nedsat red cell deformability er også blevet korreleret med mikrovaskulære sygdom i diabetes. ¹⁷ nylige undersøgelser forbinder hyperglykæmi, roede blodlegemer Ascorbat koncentrationer og osmotisk skrøbelighed tyder disse faktorer kan være vigtigt i udviklingen af mikrovaskulære sygdom. ¹⁸ Ektacytometry undersøgelser er i øjeblikket undervejs at undersøge denne hypotese (Parows og Levine, upublicerede data). Blod fase malaria infektion er en anden interessant avenue af roede blodlegemer deformability undersøgelser. Cellulære deformability af Plasmodium falciparum inficeret røde blodlegemer falder drastisk i løbet af 48 timer af intracellulære modning af parasitten fra ring scenen til schizont fase. Tyder på, at denne nedsat deformability tilbageføres ved modning af parasitten. Tilbageførslen falder sammen med udgivelsen af inficerede Erytrocytterne i omløb. Nedsat deformability menes at være medieret af Plasmodium proteiner, at fremmer binding af røde blodlegemer. ¹⁹ disse undersøgelser repræsenterer et lille udsnit af klinisk vigtige betingelser hvor måling erytrocyt deformability og osmotisk gradient parametre er relevante. Flere yderligere områder af undersøgelsen findes.

Alternative teknikker til måling af roede blodlegemer deformability omfatter optiske pincet (også kendt som laser fælder), som bruger de fysiske egenskaber af fotoner til at strække enkelt røde celler i en eller flere retninger. ²⁰ denne teknik har fordelen at måle deformability af enkelt erytrocytter, men nogle usikkerhed i kraft kalibrering har produceret betydelig variation på tværs af undersøgelser ²¹ og analyse af data kan være arbejdskrævende medmindre automatiseret. ²² mikropipette aspiration, som bruger undertryk til Aspirér en erytrocyt i en mikropipette, er også blevet brugt til at måle deformability af røde blodlegemer. ^{7 , 23} flere målinger, såsom den tryk til Aspirér cellen rød er muligt med hver foranstaltning forskellige kendetegn, de røde blodlegemer. ²³ atomic force mikroskopi er en høj opløsning teknik, der måler membran stivhed af kvantificere laser stråle afbøjning som indikator af cantilever afbøjning langs overfladen af en rød celle. ²⁴ disse teknikker giver oplysninger om individuelle erytrocytter, er ikke let tilpasses til at måle ændringer i populationer af røde blodlegemer, og generelt kræver betydelige tekniske ekspertise.

Lyst til at prøve både enkelte og populationer af celler samtidigt har ført til fremskridt inden for automation og udviklingen af mikrofluidik og array-baserede metoder. Ligesom ektacytometry, rheoscopy måler deformability som en funktion af shear stress, men billeder er erhvervet direkte via mikroskop. ²⁵ for højere gennem læg analyser, automatiseret celle imaging har været ansat til at producere deformability distributioner ved hjælp af rheoscope. ²⁶ cellulære heterogenitet kan kvantificeres ved denne metode, hvis der foreligger data fra en sund kontrol genstand. ²⁷ mikrofluidik teknikker også giver mulighed for højt gennem læg analyser af enkelt celler; flere designs ved hjælp af tilpasninger af filtrering,²⁸ celle transit analyzers,²⁹ , som måler den tid, der kræves for en erytrocyt flow gennem en micropore og alternativer, der måler det pres der kræves for erytrocyt transit snarere end tiden ³⁰ er blevet udviklet. En anden platform for høj gennem læg analyse af enkelte celler er enkelt celle microchamber array chip, som har den ekstra fordel giver mulighed for downstream fluorescens-baserede karakterisering af celler. ³¹ selvom hver af disse teknikker er potentielt nyttige og muligvis er overlegen i forhold til særlige anvendelser, de komparative fordele af ektacytometry omfatter følsomhed, brugervenlighed, og præcision. ³² den nyeste generation af kommercielt tilgængelig ektacytometers også besidder stor alsidighed i antallet af assays, der kan udføres.

Protocol

Alle emner i denne undersøgelse gav skriftlig informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og de nationale institutter for institutionelle anmeldelse Sundhedsstyrelsen godkendt protokoller. 1. drejning på ektacytometer Tilslut slangen fra den rengøringsmiddel til lav og høj osmolar polyvinylpyrrolidon (PVP) løsninger. Vær omhyggelig med at forbinde 0 osmolar røret til den lave osmolar løsning og 500 osmolar røret til den høje osmolar løsning.<strong…

Representative Results

Ektacytometry resultater er beskrevet i dette håndskrift kan bruges til at måle red cell deformability i enhver tilstand. En skematisk for det generelt, der er oprettet af en ektacytometer er vist i figur 1. Homogene befolkninger af erytrocytter vil producere en elliptisk diffraktionsmønster som reaktion på stigende shear stress, der kan bruges til at beregne brudforlængelse index som vist i figur 2. Der forekommer diffrakti…

Discussion

De ektacytometry teknikker beskrevet er ligetil og godt automatiseret, sikre gyldig og reproducerbare resultater. Ikke desto mindre findes nogle kritiske trin. Rette temperaturkontrol af blodet er vigtigt. Opbevaring ved stuetemperatur i mere end otte timer kan påvirke SS ½ værdier. ³⁴ sikring, temperatur af maskinen er stabil ved 37 ° C er også vigtigt, som viskositet af suspending medium er temperatur afhængige. Blod bør være fuldt iltet for at undgå nedsat deformability som følge af i…

Materials

LoRRca MaxSis standard version	Mechatronics	LORC109000
LoRRca MaxSis Osmoscan	Mechatronics	LORC109001
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm	Mechatronics	QRR030910
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm	Mechatronics	QRR030930
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials	Mechatronics	QRR030901
X clean	Mechatronics	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 filter tips	MidSci	AV200-H
P1250 filter tips	MidSci	AV1250-H
Kimwipes	MidSci	8091
1.5 mL eppendorf tubes	MidSci	AVSS1700
15 mL conical vial	MidSci	C15R