Meten van vervormbaarheid en rode cel heterogeniteit in bloed door Ektacytometry

Summary

Hier presenteren we technieken voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel en cellulaire heterogeniteit door ektacytometry. Deze technieken zijn van toepassing op de algemene onderzoeken van rode cel vervormbaarheid en specifieke onderzoeken van bloed ziekten gekenmerkt door de aanwezigheid van zowel stijve als vervormbare erytrocyten in omloop, zoals sikkelcelanemie.

Abstract

Verminderde rode cel vervormbaarheid is kenmerkend voor verschillende stoornissen. In sommige gevallen kan de omvang van de defecte vervormbaarheid voorspellen ernst van ziekte of voorkomen van ernstige complicaties. Ektacytometry gebruik laser diffractie viscometrie voor het meten van de vervormbaarheid van de rode bloedcellen aan toenemende shear stress of een osmotische gradiënt op een constante waarde van toegepaste schuifspanning. Directe vervormbaarheid metingen zijn echter moeilijk te interpreteren bij het meten van heterogene bloed die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van zowel stijve als vervormbare rode bloedcellen. Dit is te wijten aan het onvermogen van stijve cellen naar behoren worden uitgelijnd in reactie op schuifspanning en resultaten in een patroon van de vervormde diffractie gekenmerkt door een overdreven afname van de schijnbare vervormbaarheid. Meting van de mate van vervorming biedt een indicatie voor de heterogeniteit van de erythrocyten in bloed. In sikkelcelanemie, is dit gecorreleerd met het percentage van stijve cellen, waarin de concentratie van hemoglobine en hemoglobine samenstelling van de erythrocyten. Naast het meten van vervormbaarheid, biedt osmotische gradiënt ektacytometry informatie over de osmotische fragiliteit en hydratatie status van erytrocyten. Deze parameters geven ook de samenstelling van de hemoglobine van de rode bloedcellen van sikkelcel patiënten. Ektacytometry meet vervormbaarheid bij populaties van rode bloedcellen en, daarom geeft informatie niet op de vervormbaarheid of mechanische eigenschappen van individuele erytrocyten. Hoe dan ook, is het doel van de technieken die hier beschreven bedoeld als een handige en betrouwbare methode voor het meten van de vervormbaarheid en cellulaire heterogeniteit van bloed. Deze technieken kunnen nuttig zijn voor toezicht op de temporele veranderingen, evenals de progressie van de ziekte en de reactie op therapeutische interventie in verschillende stoornissen. Sikkelcel anemie is een goed gekarakteriseerd voorbeeld. Andere mogelijke aandoeningen waar metingen van de vervormbaarheid van de rode cel en/of heterogeniteit van belang zijn zijn bloed opslag, diabetes, Plasmodium infectie, ijzertekort en het hemolytisch-anemias als gevolg van gebreken van het membraan.

Introduction

Ektacytometry biedt een handige maatstaf voor de vervormbaarheid van de rode cel in reactie op wijzigingen in de schuifspanning (gemeten in Pascal (Pa)) of op te schorten middellange osmolaliteit. Relevante parameters van de vervormbaarheid van de rode cel omvatten de maximale rek-index (EI Max), een maat voor de maximale vervormbaarheid van een rode cel in reactie op de toenemende schuifspanning en schuifspanning ½ (SS ½), de schuifspanning vereist om de helft van de maximale vervormbaarheid. ¹ osmotische gradiënt ektacytometry heeft verschillende informatieve parameters. Deze omvatten de rek index minimale (EI Min), een maat voor oppervlakte-naar-volumeverhouding en de osmolaliteit waartegen het zich voordoet (O Min), die is een maatregel van osmotische fragiliteit. EI Max en de osmolaliteit waartegen het zich voordoet (O (EI Max)) bevatten informatie over membraan flexibiliteit en cel-oppervlakte. Helft van de maximale rek in de hypertonic arm van de osmotische gradiënt wordt vertegenwoordigd door EI hyper. EI hyper en de osmolaliteit waartegen deze optreedt, O hyper, geven informatie over de intracellulaire viscositeit van de rode cel die wordt bepaald door de concentratie van hemoglobine. ^{2 , 3} Measuring vervormbaarheid in heterogene bloed wordt bemoeilijkt door het feit dat stijve cellen, zoals sickled rode bloedcellen, doen niet goed is uitgelijnd met de richting van de stroom zoals vervormbare cellen in reactie op de verhoging van de schuifspanning. In plaats van een karakteristiek elliptische diffractie beeld produceren, produceren stijve cellen een sferische patroon dat in een diamant-vormige diffractie patroon resulteert als ze elkaar overlappen op de ellips geproduceerd door vervormbare cellen. ^{4 , 5 , 6} de sferische patroon is aangetoond dat correspondeert met onherroepelijk sickled cellen door het uitvoeren van ektacytometry op geïsoleerde breuken van cellen na centrifugeren van de dichtheid. ⁶ de berekening van de index van de rek opgenomen maatregelen voor zowel de lange en korte as van de ellips; vorm van een diamant produceert daarom een duidelijke afname van de rek doordat de breedte van de korte as. ⁷ het is eerder aangetoond dat de mate van diffractie patroon vervorming is gecorreleerd met zowel de percentage van sikkelcel-hemoglobine (HbS) en het percentage van sickled cellen in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. ⁵ de mate van diffractie patroon vervorming kan worden verkregen door complexe wiskundige analyses. ⁸ het kan ook worden verkregen door de opening van het diafragma van de camera op de ektacytometer of het grijs niveau van de software van de montage te wijzigen van de diffractie patroon hoogte aan te passen. ⁵ echter details met betrekking tot het aanpassen van de grijze niveau zijn niet goed gedefinieerd en het diafragma van de camera is niet toegankelijk op de nieuwste generatie van de verkrijgbare ektacytometer. Om te omzeilen deze problemen, kan de gemakkelijk toegankelijke camera winst worden gebruikt om aan te passen diffractie patroon hoogten. ⁹ gebruik deze methode voor de raming van de cellulaire heterogeniteit, kan de mate van diffractie patroon vervorming worden gecorreleerd met het percentage van fetal hemoglobine in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. ¹⁰ verschillende osmotische gradiënt ektacytometry parameters zijn eveneens gecorreleerd met het percentage van foetale of sikkelcelanemie hemoglobine in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. Diffractie patroon vervorming correlaties waarschijnlijk weerspiegelen de bijdrage van hemoglobine samenstelling aan het percentage van stijve, niet-vervormbare cellen. Van extra belang ondergaat het hele osmotische gradiënt ektacytometry profiel tweefase veranderingen die correspondeert met het percentage dichte cellen in omloop tijdens de crisis van de sikkelcel. ¹¹

Ektacytometry is eveneens nuttig in de studie van verschillende andere stoornissen. Osmotische gradiënt ektacytometry is diagnostische voor de overgenomen rode cel membraan stoornissen, zoals erfelijke spherocytosis, erfelijke elliptocytosis en erfelijke pyropoikilocytosis. ^{3 , 12 , 13 , 14} verminderde vervormbaarheid treedt op in ijzertekort. ¹⁵ karakterisering van de “opslag laesie” van bloed heeft ektacytometry en toekomstige studies onderzoeken van zowel de aard van de laesie en interventies ter voorkoming van haar ontstaan tijdens de opslag van overhellende bloed zijn waarschijnlijk om te profiteren van de technieken die hier gepresenteerd. ¹⁶ verminderde rode cel vervormbaarheid heeft ook zijn gecorreleerd met microvasculaire ziekte in diabetes. ¹⁷ recente studies koppelen hyperglycemie, rode cel ascorbaat concentraties en osmotische fragiliteit suggereren dat deze factoren belangrijk zijn in de ontwikkeling van microvasculaire ziekte kunnen zijn. ¹⁸ Ektacytometry onderzoeken zijn momenteel aan de gang te onderzoeken van deze hypothese (Parrow en Levine, ongepubliceerde gegevens). Malaria infectie van het fase van Blood is een andere interessante laan van rode cel vervormbaarheid onderzoeken. Cellulaire vervormbaarheid van Plasmodium falciparum geïnfecteerd rode bloedcellen daalt dramatisch tijdens de 48 uren van intracellulaire rijping van de parasiet van ring fase naar fase van schizont. Blijkt dat deze verminderde vervormbaarheid wordt omgekeerd op de rijping van de parasiet. De omkering samenvalt met de release van de geïnfecteerde rode bloedcellen in de circulatie. Verminderde vervormbaarheid wordt gedacht te worden bemiddeld door Plasmodium eiwitten ter bevordering van de sekwestratie van de rode cel. ¹⁹ deze studies zijn een kleine steekproef van klinisch belangrijke voorwaarden waar meten erytrocyt vervormbaarheid en osmotische gradiënt parameters relevant zijn. Er bestaan verschillende extra gebieden van studie.

Alternatieve technieken voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel omvatten optisch pincet (ook bekend als laser vallen) die de fysische eigenschappen van fotonen te rekken één rode bloedcellen in een of meerdere richtingen te gebruiken. ²⁰ deze techniek heeft het voordeel voor het meten van de vervormbaarheid van één erytrocyten, maar enige onzekerheid kalibratie van de kracht heeft aanzienlijke variabiliteit over studies ²¹ en data-analyse kan arbeidsintensief tenzij geautomatiseerd. ²² micropipet aspiratie, die gecombineerd een erytrocyt in een micropipet met behulp van negatieve druk, is ook gebruikt voor het meten van de vervormbaarheid van de rode bloedcellen. ^{7 , 23} meerdere metingen, zoals de druk moeten de rode cel, gecombineerd zijn mogelijk met elke maatregel bepaling van verschillende kenmerken van de rode cel. ²³ atomic force microscopie is een hoge resolutie-techniek, die membraan stijfheid maatregelen door het kwantificeren van de laser beam doorbuiging als een indicator van de uitwijking van de ‘ Freischwinger ‘ langs het oppervlak van een rode cel. ²⁴ deze technieken bieden informatie over individuele erytrocyten, niet gemakkelijk om te meten van de veranderingen in populaties van rode bloedcellen, en, in het algemeen, vereisen aanzienlijke technische expertise zijn aangepast.

De wens om te genieten van zowel de individuele als de populaties van cellen tegelijk heeft geleid tot vooruitgang in de automatisering en de ontwikkeling van microfluidics en matrix gebaseerde methoden. Zoals ektacytometry, rheoscopy meet vervormbaarheid als een functie van shear stress maar beelden direct via Microscoop zijn verworven. ²⁵ voor hogere via-put analyses, geautomatiseerde cel imaging heeft gewerkt voor de productie van de vervormbaarheid distributies met behulp van de rheoscope. ²⁶ cellulaire heterogeniteit kan worden gekwantificeerd door deze methode als gegevens van een gezonde controle onderwerp beschikbaar zijn. ²⁷ Microfluidics technieken ook toestaan voor hoge via-put-analyses van afzonderlijke cellen; meerdere ontwerpen met behulp van aanpassingen van filtratie,²⁸ cel transit analyzers,²⁹ , die de tijd die nodig is voor een erytrocyt stroom door een schoon meet en alternatieven die meten van de druk die nodig zijn voor de erytrocyt transit eerder dan tijd ³⁰ zijn ontwikkeld. Een ander platform voor hoge via-put analyse van afzonderlijke cellen is de eencellige microchamber matrix chip, die het extra voordeel heeft van het toestaan voor downstream fluorescentie gebaseerde karakterisering van de cellen. ³¹ Hoewel elk van deze technieken is potentieel nuttig en kan zijn superieur voor bepaalde toepassingen, inclusief de comparatieve voordelen van ektacytometry gevoeligheid, gebruiksgemak, en precisie. ³² de nieuwste generatie van commercieel verkrijgbare ektacytometers bezitten ook aanzienlijke veelzijdigheid in het aantal tests die kunnen worden uitgevoerd.

Protocol

Alle onderwerpen in deze studie gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming overeenkomstig de verklaring van Helsinki en de nationale instituten van gezondheid institutionele Review Board goedgekeurd-protocollen. 1. inschakelen de ektacytometer Sluit de slang van de reiniging oplossing aan de lage en hoge osmolar Polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossingen. Wees voorzichtig om verbinding te maken met de 0 osmolar buis aan de lage osmolar-oplossing en de 500 osmolar buis aan de hoge osmola…

Representative Results

De resultaten van de ektacytometry die worden beschreven in dit manuscript kunnen worden gebruikt voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel in elke conditie. Een schematische voorstelling van de algemene set-up van een ektacytometer is afgebeeld in Figuur 1. Homogene populaties van erytrocyten zal produceren een elliptische diffractie patroon in reactie op de toenemende shear stress die kan worden gebruikt voor de berekening van de index van de re…

Discussion

De beschreven technieken van de ektacytometry zijn eenvoudig en goed geautomatiseerde, geldig en reproduceerbare resultaten te waarborgen. Niettemin bestaan enkele kritische stappen. Juiste temperatuurcontrole van het bloed is belangrijk. Opslag bij kamertemperatuur gedurende meer dan acht uur van invloed kan zijn op de SS ½ waarden. ³⁴ ervoor zorgen dat de temperatuur van de machine stabiel bij 37 ° C is is ook belangrijk, want de viscositeit van het opschorten medium is temperatuur afhankelijk…

Materials

LoRRca MaxSis standard version	Mechatronics	LORC109000
LoRRca MaxSis Osmoscan	Mechatronics	LORC109001
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm	Mechatronics	QRR030910
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm	Mechatronics	QRR030930
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials	Mechatronics	QRR030901
X clean	Mechatronics	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 filter tips	MidSci	AV200-H
P1250 filter tips	MidSci	AV1250-H
Kimwipes	MidSci	8091
1.5 mL eppendorf tubes	MidSci	AVSS1700
15 mL conical vial	MidSci	C15R