Ektacytometry द्वारा रक्त में विकृति और लाल कोशिका विविधता को मापने
Summary
यहां हम ektacytometry द्वारा लाल कोशिका विकृति और सेलुलर विविधता को मापने के लिए तकनीक पेश करते हैं । इन तकनीकों में लाल कोशिका विकृति और रक्त परिसंचरण में दोनों कठोर और विकृत लाल कोशिकाओं की उपस्थिति के द्वारा विशेषता की विशिष्ट जांच के सामान्य जांच करने के लिए लागू कर रहे हैं, ऐसे सिकल सेल एनीमिया के रूप में ।
Abstract
कम लाल कोशिका विकृति कई विकारों की विशेषता है । कुछ मामलों में, दोषपूर्ण विकृति की हद तक रोग या गंभीर जटिलताओं की घटना की गंभीरता की भविष्यवाणी कर सकते हैं । Ektacytometry लेजर विवर्तन viscometry का उपयोग करता है लाल रक्त कोशिकाओं की विकृति को मापने के लिए या तो बढ़ती कतरनी तनाव या लागू कतरनी तनाव के एक निरंतर मूल्य पर एक परासरणी ढाल के अधीन । हालांकि, प्रत्यक्ष विकृति माप heterogenous रक्त है कि दोनों कठोर और विकृत लाल कोशिकाओं की उपस्थिति की विशेषता है को मापने जब व्याख्या करने के लिए मुश्किल हैं । यह कठोर कोशिकाओं की अक्षमता के कारण ठीक से कतरनी तनाव और एक विकृत विवर्तन स्पष्ट विकृति में एक अतिरंजित कमी द्वारा चिह्नित पैटर्न में परिणाम के जवाब में संरेखित करने के लिए है । विकृति की डिग्री की माप रक्त में एरिथ्रोसाइट्स के विविधता का एक संकेतक प्रदान करता है । सिकल सेल एनीमिया में, यह कठोर कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ संबंधित है, जो एरिथ्रोसाइट्स की हीमोग्लोबिन एकाग्रता और हीमोग्लोबिन संरचना को दर्शाता है. विकृति को मापने के अलावा, परासरणी ढाल ektacytometry परासरणी कमजोरी और एरिथ्रोसाइट्स के जलयोजन स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करता है । ये पैरामीटर सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं की हीमोग्लोबिन रचना को भी दर्शाते हैं । Ektacytometry उपाय लाल कोशिकाओं की आबादी में विकृति और नहीं है, इसलिए, विकृति या व्यक्तिगत एरिथ्रोसाइट्स के यांत्रिक गुणों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । बावजूद, यहां वर्णित तकनीकों का लक्ष्य रक्त की विकृति और सेलुलर विविधता को मापने के लिए एक सुविधाजनक और विश्वसनीय तरीका प्रदान करना है । इन तकनीकों लौकिक परिवर्तन की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है, साथ ही रोग प्रगति और कई विकारों में चिकित्सीय हस्तक्षेप के जवाब । सिकल सेल एनीमिया एक अच्छी तरह से विशेषता उदाहरण है । अंय संभावित विकारों जहां लाल कोशिका विकृति और/या विविधता की माप ब्याज की है शामिल रक्त भंडारण, मधुमेह, प्लाज्मोडियम संक्रमण, आयरन की कमी, और रक्तलायी झिल्ली दोषों के कारण एनीमिया ।
Introduction
Ektacytometry कतरनी तनाव में परिवर्तन के जवाब में लाल कोशिका विकृति का एक सुविधाजनक उपाय प्रदान करता है (पास्कल (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) में मापा) या मध्यम परासरणीयता सस्पैंड । लाल कोशिका विकृति के उचित मापदंडों अधिकतम बढ़ाव सूचकांक (ेि मैक्स), कतरनी तनाव को बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया में एक लाल कोशिका की अधिकतम विकृति का एक उपाय शामिल हैं, और कतरनी तनाव ½ (एसएस ½), कतरनी तनाव आधा अधिक से अधिक प्राप्त करने के लिए आवश्यक विकृति । 1 परासरणी ग्रैडिएंट ektacytometry में कई जानकारीपूर्ण पैरामीटर हैं । ये बढ़ाव सूचकांक न्यूनतम (ेि मिनट), सतह से माप अनुपात और परासरणीयता जिस पर यह (हे मिनट) होता है, जो परासरणी कमजोरी का एक उपाय है का एक उपाय शामिल हैं । ेि मैक्स और परासरणीयता जिस पर यह होता है (ओ (ेि मैक्स)) झिल्ली लचीलापन और कोशिका सतह क्षेत्र के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । परासरणी ढाल के hypertonic हाथ में आधा अधिक से अधिक बढ़ाव ेि हाइपर द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । ेि हाइपर और परासरणीयता जिस पर यह होता है, हे हाइपर, लाल कोशिका के intracellular चिपचिपाहट के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जो हीमोग्लोबिन एकाग्रता से निर्धारित होता है. 2 , 3 heterogenous रक्त में विकृति को मापने तथ्य यह है कि इस तरह के सिकली लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में कठोर कोशिकाओं, ठीक तरह से कतरनी तनाव बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया में विकृत कोशिकाओं के रूप में प्रवाह की दिशा के साथ संरेखित नहीं है द्वारा जटिल है । बल्कि एक विशेषता अंडाकार विवर्तन छवि का निर्माण, कठोर कोशिकाओं एक गोलाकार पैटर्न जो एक हीरे के आकार का विवर्तन पैटर्न में परिणाम जब विकृति कोशिकाओं द्वारा उत्पादित दीर्घवृत्त पर मढ़ा उत्पादन । 4 , 5 , 6 गोलाकार पैटर्न घनत्व केंद्रापसारक निंनलिखित कोशिकाओं के पृथक भागों पर ektacytometry प्रदर्शन से अचल सिकल्ड कोशिकाओं के अनुरूप दिखाया गया है । 6 बढ़ाव अनुक्रमणिका परिकलन में दीर्घवृत्त के दीर्घ और लघु अक्ष दोनों के उपाय शामिल हैं; एक हीरे की आकृति इसलिए कम धुरी की चौड़ाई में वृद्धि से बढ़ाव में एक स्पष्ट कमी पैदा करता है । 7 यह पहले से दिखाया गया है कि विवर्तन पैटर्न विकृति की डिग्री दोनों सिकल हीमोग्लोबिन का प्रतिशत (एचबीएस) और सिकल सेल एनीमिया के साथ रोगियों से रक्त में सिकलेड कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ संबंधित है । 5 विवर्तन पैटर्न विरूपण की डिग्री जटिल गणितीय विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । 8 यह भी ektacytometer या फिटिंग सॉफ्टवेयर के ग्रे स्तर विवर्तन पैटर्न ऊंचाई को बदलने पर कैमरा एपर्चर के उद्घाटन का समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता है । 5 तथापि, कैसे भूरे रंग के स्तर को समायोजित करने के बारे में जानकारी अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे है और कैमरा एपर्चर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ektacytometer की नवीनतम पीढ़ी पर आसानी से सुलभ नहीं है । इन मुद्दों को दरकिनार, आसानी से सुलभ कैमरा लाभ विवर्तन पैटर्न ऊंचाइयों को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 9 सेलुलर विविधता का अनुमान लगाने के लिए इस विधि का उपयोग करना, विवर्तन पैटर्न विकृति की डिग्री सिकल सेल एनीमिया के साथ रोगियों के रक्त में भ्रूण हीमोग्लोबिन के प्रतिशत के साथ संबद्ध किया जा सकता है । 10 कई परासरणी ढाल ektacytometry मानकों इसी तरह सिकल सेल एनीमिया के साथ रोगियों से रक्त में भ्रूण या सिकल हीमोग्लोबिन के प्रतिशत के साथ संबंधित हैं । विवर्तन पैटर्न विरूपण सहसंबंध की संभावना कठोर, गैर विकृत कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए हीमोग्लोबिन संरचना के योगदान को प्रतिबिंबित । अतिरिक्त ब्याज की, पूरे परासरणी ढाल ektacytometry प्रोफ़ाइल परिवर्तन है कि सिकल सेल संकट के दौरान संचलन में घने कोशिकाओं के प्रतिशत के अनुरूप biphasic । 11
Ektacytometry इसी तरह कई अंय विकारों के अध्ययन में उपयोगी है । परासरणी ग्रैडिएंट ektacytometry वंशानुगत spherocytosis, वंशानुगत elliptocytosis और वंशानुगत pyropoikilocytosis के रूप में इनहेरिट की गई लाल कोशिका झिल्ली विकारों, के लिए नैदानिक है । 3 , 12 , 13 , १४ घटी हुई विकृति लोहे की कमी में होती है. 15 रक्त के “भंडारण घाव” के लक्षण वर्णन ektacytometry और भविष्य घाव और हस्तक्षेप की दोनों प्रकृति की जांच के अध्ययन कार्यरत है बैंक रक्त के भंडारण के दौरान इसके गठन को रोकने के लिए से लाभ होने की संभावना है यहां प्रस्तुत तकनीक । 16 कम लाल कोशिका विकृति भी मधुमेह में microvascular रोग के साथ संबंधित किया गया है । 17 हाल ही में hyperglycemia जोड़ने के अध्ययन, लाल कोशिका ascorbate सांद्रता और परासरणी कमजोरी सुझाव है कि इन कारकों microvascular रोग के विकास में महत्वपूर्ण हो सकता है । इस परिकल्पना (Parrow और Levine, अप्रकाशित डाटा) की जांच के लिए 18 Ektacytometry अध्ययन अभी चल रहे हैं । रक्त चरण मलेरिया संक्रमण लाल कोशिका विकृति जांच का एक और दिलचस्प एवेंयू है । सेलुलर प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं की विकृति नाटकीय रूप से schizont चरण के लिए अंगूठी चरण से परजीवी की intracellular परिपक्वता के ४८ घंटे के दौरान घट जाती है । सबूत यह कम विकृति परजीवी की परिपक्वता पर उलट है कि इंगित करता है । उलटा संचलन में संक्रमित लाल कोशिकाओं की रिहाई के साथ मेल खाता है । कमी विकृति के लिए प्लाज्मोडियम प्रोटीन है कि लाल सेल के ज़ब्ती को बढ़ावा देने के द्वारा मध्यस्थता माना जाता है । 19 ये अध्ययन नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण स्थितियों के एक छोटे नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां एरिथ्रोसाइट विकृति और परासरणी ग्रैडिएंट पैरामीटर्स को मापने के लिए प्रासंगिक हैं । अध्ययन के कई अतिरिक्त क्षेत्र मौजूद हैं ।
लाल कोशिका विकृति को मापने के लिए वैकल्पिक तकनीकों ऑप्टिकल चिमटी (भी लेजर जाल के रूप में जाना जाता है) जो फोटॉनों के भौतिक गुणों का उपयोग एक या एक से अधिक दिशाओं में एकल लाल कोशिकाओं खिंचाव शामिल हैं । 20 इस तकनीक एकल एरिथ्रोसाइट्स की विकृति को मापने का लाभ है, लेकिन कुछ अनिश्चितता बल अंशांकन में काफी परिवर्तनशीलता का उत्पादन किया गया है 21 अध्ययन और डेटा विश्लेषण परिश्रम हो सकता है जब तक स्वचालित. 22 Micropipette आकांक्षा, जो एक Micropipette में एक एरिथ्रोसाइट महाप्राण करने के लिए नकारात्मक दबाव का उपयोग करता है, भी लाल कोशिकाओं की विकृति को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । 7 , लाल कोशिका महाप्राण करने के लिए आवश्यक दबाव के रूप में 23 एकाधिक माप, लाल कोशिका के विभिन्न विशेषताओं को परिभाषित प्रत्येक उपाय के साथ संभव है. 23 परमाणु सेना माइक्रोस्कोपी एक उच्च संकल्प तकनीक है कि एक लाल कोशिका की सतह के साथ ब्रैकट विक्षेपन के एक संकेतक के रूप में लेजर बीम विक्षेपन को बढ़ाता द्वारा झिल्ली कठोरता उपाय है । 24 इन तकनीकों व्यक्तिगत एरिथ्रोसाइट्स के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, आसानी से लाल रक्त कोशिकाओं की आबादी में परिवर्तन को मापने के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं, और, सामांय में, काफी तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है ।
दोनों व्यक्तिगत और कोशिकाओं की आबादी के नमूने की इच्छा एक साथ स्वचालन में प्रगति और microfluidics और सरणी आधारित तरीकों के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है. ektacytometry की तरह, rheoscopy कतरनी तनाव के एक समारोह के रूप में विकृति लेकिन छवियों सीधे माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं । 25 के लिए उच्च के माध्यम से डाल विश्लेषण, स्वचालित सेल इमेजिंग rheoscope का उपयोग कर विकृति वितरण का उत्पादन करने के लिए नियोजित किया गया है । 26 सेलुलर विविधता इस विधि से मात्रा जा सकता है अगर एक स्वस्थ नियंत्रण विषय से डेटा उपलब्ध हैं । 27 Microfluidics तकनीक भी उच्च के माध्यम से एकल कोशिकाओं के विश्लेषण डाल के लिए अनुमति देते हैं; एकाधिक निस्पंदन के रूपांतरों का उपयोग डिजाइन,28 सेल पारगमन विश्लेषक,29 जो एक micropore के माध्यम से एक एरिथ्रोसाइट प्रवाह के लिए आवश्यक समय उपाय, और विकल्प है कि एरिथ्रोसाइट पारगमन के लिए आवश्यक दबाव को मापने के बजाय समय से 30 का विकास किया गया है । व्यक्तिगत कोशिकाओं के उच्च के माध्यम से डाल विश्लेषण के लिए एक और मंच एकल कोशिका microchamber सरणी चिप है, जो अनुप्रवाह प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति के अतिरिक्त लाभ-कोशिकाओं के लक्षण वर्णन आधारित है । 31 हालांकि इन तकनीकों में से प्रत्येक संभावित उपयोगी है और विशेष अनुप्रयोगों के लिए बेहतर हो सकता है, ektacytometry के तुलनात्मक लाभ संवेदनशीलता, उपयोग में आसानी, और परिशुद्धता भी शामिल है । ३२ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ektacytometers की नवीनतम पीढ़ी भी परख की संख्या में काफी बहुमुखी प्रतिभा के अधिकारी है कि प्रदर्शन किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ektacytometry तकनीकों का वर्णन स्पष्ट और अच्छी तरह से स्वचालित कर रहे हैं, वैध और प्रतिलिपि परिणाम सुनिश्चित करने । इसके बावजूद कुछ अहम कदम मौजूद हैं. रक्त का उचित तापमान नियंत्रण महत्वपूर्ण है । आठ घंटे से अधि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य में मधुमेह, पाचन और गुर्दे की बीमारियों के राष्ट्रीय संस्थानों और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के रक्त संस्थान के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम का समर्थन किया गया. इस के साथ साथ व्यक्त राय लेखकों की एकमात्र जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
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