Misurazione di deformabilità e l'eterogeneità delle cellule rosse nel sangue di ektacitometria
Summary
Qui vi presentiamo le tecniche per misurare la deformabilità del globulo rosso ed eterogeneità cellulare di ektacitometria. Queste tecniche sono applicabili a indagini generali di deformabilità del globulo rosso e indagini specifiche di malattie del sangue caratterizzate dalla presenza di globuli rossi sia rigidi sia deformabili in circolazione, quali anemia falciforme.
Abstract
Deformabilità del globulo rosso in diminuzione è caratteristica di parecchi disordini. In alcuni casi, nella misura di deformabilità difettoso può predire la gravità della malattia o la comparsa di gravi complicazioni. Ektacitometria usi laser viscosimetria di diffrazione per misurare la deformabilità dei globuli rossi soggetto a crescente sollecitazione di taglio o un gradiente osmotico ad un valore costante di sollecitazione di taglio applicata. Tuttavia, misurazioni di deformabilità diretto sono difficili da interpretare durante la misurazione sangue eterogeneo che si caratterizza per la presenza di globuli rossi sia rigidi che deformabili. Ciò è dovuto l’incapacità delle cellule rigide per allineare correttamente in risposta alla sollecitazione di taglio e risultati in un pattern di diffrazione distorta contrassegnato da un’esagerata diminuzione apparente deformabilità. Misurazione del grado di distorsione fornisce un indicatore dell’eterogeneità degli eritrociti nel sangue. Nell’anemia falciforme, ciò è correlata con la percentuale di cellule rigide, che riflette la concentrazione di emoglobina e la composizione dell’emoglobina degli eritrociti. Oltre a misurare la deformabilità, gradiente osmotico ektacitometria fornisce informazioni circa la fragilità osmotica e lo stato di idratazione degli eritrociti. Questi parametri anche riflettano la composizione dell’emoglobina dei globuli rossi dai pazienti delle cellule di falce. Ektacitometria misura deformabilità nelle popolazioni delle cellule rosse e non, pertanto, fornire informazioni sulla deformabilità o proprietà meccaniche dei singoli eritrociti. Indipendentemente da ciò, l’obiettivo delle tecniche descritte nel presente documento è fornire un metodo conveniente e affidabile per misurare la deformabilità e l’eterogeneità cellulare del sangue. Queste tecniche possono essere utile per monitorare i cambiamenti temporali, come pure la progressione di malattia e la risposta all’intervento terapeutico in parecchi disordini. Anemia falciforme è un esempio ben caratterizzato. Altri potenziali disturbi quando sono misurazioni di deformabilità del globulo rosso e/o eterogeneità di interesse includono la conservazione del sangue, diabete, infezione Plasmodium , carenza di ferro e le anemie emolitiche dovuto i difetti della membrana.
Introduction
Ektacitometria fornisce una misura comoda di deformabilità del globulo rosso in risposta ad alterazioni nella sollecitazione di taglio (misurata in Pascal (Pa)) o sospendendo osmolarità media. Pertinenti parametri di deformabilità del globulo rosso sono l’indice di allungamento massimo (EI Max), una misura della massima deformabilità del globulo rosso in risposta alla crescente sollecitazione di taglio e shear stress ½ (SS ½), la sollecitazione di taglio necessaria per raggiungere metà maximal deformabilità. 1 ektacitometria gradiente osmotico ha diversi parametri informativi. Questi includono l’indice di allungamento minimo (EI Min), una misura del rapporto superficie-volume e l’osmolalità in cui esso si verifica (O Min), che è una misura della fragilità osmotica. EI Max e il osmolality in cui esso si verifica (O (EI Max)) è possibile fornire informazioni sull’area di superficie della membrana delle cellule e di flessibilità. Allungamento massimo mezza nel braccio ipertonico del gradiente osmotico è rappresentato da EI iper. EI iper e il osmolality in cui esso si verifica, O iper, forniscono informazioni circa la viscosità intracellulare del globulo rosso che è determinata dalla concentrazione nell’emoglobina. 2 , 3 misurazione deformabilità nel sangue eterogeneo è complicata dal fatto che cellule rigide, come globuli rossi falciformi, non sia ben allineata con la direzione del flusso ad esempio cellule deformabile in risposta alla crescente sollecitazione di taglio. Piuttosto che produrre un’immagine di diffrazione ellittica caratteristica, rigide cellule producono un modello sferico che si traduce in un pattern di diffrazione a forma di diamante quando sovrapposte sull’ellisse prodotta dalle cellule deformabile. 4 , 5 , 6 il modello sferico è stato indicato per corrispondono alle cellule irreversibilmente sickled eseguendo ektacitometria sulle frazioni isolate delle cellule dopo la centrifugazione di densità. 6 il calcolo di indice di allungamento include misure dell’asse lungo e breve dell’ellisse; forma di diamante, di conseguenza, produce un’apparente diminuzione in allungamento aumentando la larghezza dell’asse corto. 7 è stato precedentemente dimostrato che il grado di distorsione del reticolo di diffrazione è correlato con la percentuale di emoglobina falciforme (HbS) e la percentuale delle cellule falciformi nel sangue dai pazienti con anemia falciforme. 5 il grado di distorsione del reticolo di diffrazione può essere ottenuto da analisi matematiche complesse. 8 può essere ottenuto anche regolando l’apertura del diaframma della fotocamera sul ektacytometer o il livello di grigio del raccordo software per modificare l’altezza del reticolo di diffrazione. 5 tuttavia, dettagli riguardo alle modalità di regolare il livello di grigio non sono ben definiti e l’apertura della fotocamera non è facilmente accessibile sull’ultima generazione dell’ektacytometer disponibili in commercio. Per ovviare a questi problemi, il guadagno di fotocamera facilmente accessibile consente di regolare l’altezza del reticolo di diffrazione. 9 utilizzo di questo metodo per stimare l’eterogeneità cellulare, il grado di distorsione del reticolo di diffrazione può essere correlato con la percentuale di emoglobina fetale nel sangue dei pazienti con anemia falciforme. 10 diversi parametri di ektacitometria gradiente osmotico similarmente sono correlati con la percentuale di fetale o emoglobina nel sangue dai pazienti con anemia di cellule di falce. Correlazioni di distorsione di reticolo diffrazione probabilmente riflettono il contributo di una composizione di emoglobina per la percentuale di cellule rigide, indeformabile. Di interesse supplementare, il profilo intero ektacitometria gradiente osmotico subisce cambiamenti di bifase che corrispondono alla percentuale di cellule dense nella circolazione durante crisi falcemica. 11
Ektacitometria è similarmente utile nello studio di parecchi altri disordini. Ektacitometria gradiente osmotico è diagnostico per i disturbi di membrana ereditato delle cellule rosse, come sferocitosi ereditaria, elliptocytosis ereditario e Piropoichilocitosi ereditaria. 3 , 12 , 13 , 14 ridotta deformabilità si verifica nella carenza di ferro. 15 caratterizzazione della lesione”deposito” di sangue ha impiegato ektacitometria e futuri studi che studiano sia la natura della lesione e gli interventi per impedire la sua formazione durante la conservazione del sangue versato sono suscettibili di beneficiare della tecniche qui presentate. 16 deformabilità eritrocitaria in diminuzione è stata correlata anche con malattia microvascolare in diabete. 17 recenti studi che collegano l’iperglicemia, concentrazioni nel globulo rosso dell’ascorbato e fragilità osmotica suggeriscono che questi fattori possono essere importanti nello sviluppo della malattia microvascolare. 18 ektacitometria studi sono attualmente in corso per studiare questa ipotesi (Perow e Levine, dati non pubblicati). Fase di infezione malarica del sangue è un altro interessante viale delle indagini di deformabilità del globulo rosso. Cellulare deformabilità del Plasmodium falciparum infetti globuli rossi diminuisce drammaticamente durante le 48 ore di maturazione intracellulare del parassita dalla fase di anello alla fase schizonte. La prova indica che questa diminuzione deformabilità è invertito al momento di maturazione del parassita. L’inversione coincide con rilascio di globuli rossi infetti nella circolazione. Deformabilità in diminuzione è pensato per essere mediato dalle proteine del Plasmodium che promuovono il sequestro del globulo rosso. 19 questi studi rappresentano un piccolo campione delle condizioni clinicamente importanti dove la misurazione deformabilità eritrocitaria e parametri gradienti osmotici sono rilevanti. Esistono diverse altre aree di studio.
Tecniche alternative per la misurazione di deformabilità del globulo rosso sono pinzette ottiche (note anche come trappole laser) che utilizzano le proprietà fisiche dei fotoni per allungare le singole cellule rosse in una o più direzioni. 20 questa tecnica ha il vantaggio di misurare la deformabilità degli eritrociti singoli, ma qualche incertezza in forza calibrazione ha prodotto una notevole variabilità attraverso studi 21 e analisi dei dati può essere laborioso a meno che non automatizzato. 22 aspirazione micropipetta, che utilizza la pressione negativa per aspirare un eritrociti in una micropipetta, è stato utilizzato anche per misurare la deformabilità dei globuli rossi. 7 , 23 misure multiple, ad esempio la pressione necessaria per aspirare il globulo rosso, sono possibili con ogni misura definisce le caratteristiche differenti di globulo rosso. 23 la microscopia a forza atomica è una tecnica di alta risoluzione che misura la rigidità della membrana quantificando la deflessione del fascio laser come un indicatore di deflessione a sbalzo lungo la superficie del globulo rosso. 24 queste tecniche forniscono informazioni individuali degli eritrociti, non sono facilmente adattati per misurare i cambiamenti nelle popolazioni dei globuli rossi e, in generale, richiedono una notevole competenza tecnica.
Il desiderio di assaggiare sia individuali che popolazioni di cellule contemporaneamente ha portato a progressi in automazione e lo sviluppo della microfluidica e metodi basati su matrice. Come ektacitometria, rheoscopy misura deformabilità in funzione della sollecitazione di taglio ma immagini vengono acquisite direttamente tramite microscopio. 25 per maggiore analisi attraverso-metta, formazione immagine automatizzata delle cellule è stata impiegata per produrre distribuzioni di deformabilità utilizzando il rheoscope. 26 eterogeneità cellulare può essere quantificata da questo metodo se sono disponibili dati da un oggetto di controllo in buona salute. 27 microfluidica tecniche permettono anche di alte fino analisi di singole cellule; disegni multipli usando adattamenti di filtrazione, analizzatori di transito cella28 ,29 , che misura il tempo richiesto per un flusso dell’eritrocito attraverso un microporo e alternative che misurano la pressione necessaria per il transito dell’eritrocito piuttosto oltre tempo 30 sono stati sviluppati. Un’altra piattaforma per alto fino analisi delle singole celle è il chip di matrice microchamber singola cella, che ha l’ulteriore vantaggio di consentire per la caratterizzazione di fluorescenza-basata a valle delle cellule. 31 anche se ognuna di queste tecniche è potenzialmente utile e può essere superiore per applicazioni particolari, i vantaggi comparativi di ektacitometria include sensibilità, facilità d’uso e precisione. 32 l’ultima generazione di ektacytometers disponibili in commercio anche possieda una notevole versatilità del numero di analisi che possono essere eseguite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecniche di ektacitometria descritte sono semplici e ben automatizzata, garantendo risultati validi e riproducibili. Tuttavia, esistono alcuni passaggi critici. Controllo di temperatura adeguato del sangue è importante. Stoccaggio a temperatura ambiente per più di otto ore può interessare SS ½ valori. 34 assicurando che la temperatura della macchina è stabile a 37 ° C è importante, anche come viscosità del mezzo sospendente è dipendente dalla temperatura. Sangue dovrebbe essere complet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del istituti nazionali di diabete, digestivo e malattie del rene e cuore nazionale, polmone e sangue Institute of National Institutes of Health. Le opinioni espresse nel presente documento sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
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