Måle Deformability og Red Cell heterogenitet i blodet av Ektacytometry

Summary

Her presenterer vi teknikker for å måle røde celle deformability og mobilnettet heterogenitet av ektacytometry. Disse teknikkene gjelder for generelle undersøkelser av røde celle deformability og spesifikke undersøkelser av blodsykdommer preget av tilstedeværelsen av både stive og deformerbare røde celler i omløp, slik som sigd celle anemi.

Abstract

Redusert røde celle deformability er karakteristisk for flere lidelser. I noen tilfeller kan omfanget av defekte deformability forutsi alvorlighetsgraden av sykdommen eller forekomsten av alvorlige komplikasjoner. Ektacytometry bruker laser Diffraksjon viscometry for å måle deformability av røde blodlegemer økende skjæring stress eller en osmotisk gradient i en konstant verdi på brukt skjæring stress. Men er direkte deformability mål vanskelige å tolke måle heterogene blod som er preget av tilstedeværelsen av både stive og deformerbare røde celler. Dette skyldes manglende evne til stive celler til riktig justere svar skjæring stress og resultater i et forvrengt Diffraksjon mønster preget av en overdrevet nedgang i tilsynelatende deformability. Måling av graden av forvrengning gir en indikator på heterogenitet av erytrocytter i blodet. I sigdcelleanemi, er dette korrelert med andelen stive celler, som gjenspeiler hemoglobin konsentrasjon og hemoglobin sammensetningen av Målestørrelsen på erytrocytter. I tillegg til å måle deformability, gir osmotisk gradient ektacytometry informasjon om osmotisk skjørhet og hydration status erytrocytter. Disse parameterne også gjenspeile sammensetningen hemoglobin i røde blod celler fra sigd celle pasienter. Ektacytometry måler deformability bestander av røde celler og ikke, derfor gir informasjon på deformability eller mekaniske egenskaper av personlige erytrocytter. Uansett, er målet teknikkene som beskrives her en praktisk og pålitelig metode for å måle deformability og mobilnettet heterogenitet av blod. Disse teknikkene kan være nyttig for overvåking tidsmessige endringer, samt sykdomsprogresjon og respons på terapeutisk intervensjon i flere lidelser. Sigd celle anemi er et godt karakterisert eksempel. Andre potensielle lidelser der målinger av røde celle deformability og/eller heterogenitet er av interesse inkluderer blod oppbevaring, diabetes, Plasmodium infeksjon, jernmangel og Hemolytisk-anemias på grunn av membran feil.

Introduction

Ektacytometry gir en praktisk mål på røde celle deformability svar på endringer i skjæring stress (målt i Pascal (Pa)) eller suspendere middels osmolality. Relevante parametere av røde celle deformability inkluderer maksimal forlengelse indeksen (EI Max), et mål for den maksimale deformability for en rød-celle som svar på økende skjæring stress, og skjæring stress ½ (SS ½), skjæring stress kreves for å oppnå halv maksimal deformability. ¹ osmotisk gradient ektacytometry har flere informativ parametere. Disse inkluderer forlengelse indeksen minimum (EI Min), et mål på overflaten til volumkontrollen og osmolality der det oppstår (O Min), som er et mål på osmotisk skjørhet. EI Max og osmolality der det oppstår (O (EI Max)) gir informasjon om membran fleksibilitet og celle areal. Halv maksimal forlengelse i hypertonic armen på osmotisk graderingen representeres av EI hyper. EI hyper og osmolality som det skjer, O hyper, gir informasjon om intracellulær viskositeten av red cellen som bestemmes av hemoglobin konsentrasjon. ^{2 , 3} måle deformability i heterogene blod er komplisert av det faktum at stive celler, for eksempel sickled røde blod celler, ikke riktig høyrejusteres med retningen av flyt som deformerbare celler som svar på økende skjæring stress. I stedet for å produsere et karakteristisk elliptiske Diffraksjon bilde, produsere stive cellene en sfærisk mønster som resulterer i et rombeformet Diffraksjon mønster når kledde på ellipsen produsert av deformerbare celler. ^{4 , 5 , 6} sfærisk mønsteret har vist tilsvare irreversibelt sickled celler ved å utføre ektacytometry på isolerte deler av cellene etter tetthet sentrifugering. ⁶ indeksberegning forlengelse inneholder tiltak av både lange og korte aksen av ellipsen; en rombefiguren gir derfor en åpenbar nedgang i forlengelse ved å øke bredden på kort aksen. ⁷ det har tidligere vist at graden av Diffraksjon mønster forvrengning er korrelert med både andelen sigd hemoglobin (HbS) og andelen av sickled celler i blodet fra pasienter med sigd celle anemi. ⁵ graden av Diffraksjon mønster forvrengning kan fås ved komplekse matematiske analyser. ⁸ det kan også fås ved å justere åpningen av kameraet blenderåpningen på ektacytometer eller den grå nivået av passende programvare å endre Diffraksjon mønster høyden. ⁵ men detaljer om hvordan du justerer den grå nivået er ikke godt definert og kameraet blenderåpning er ikke tilgjengelig på den nyeste generasjonen av det kommersielt tilgjengelige ektacytometer. For å omgå disse problemene, kan lett tilgjengelig kameraet gevinst brukes til å justere Diffraksjon mønster høyder. ⁹ benytter denne metoden for å anslå mobilnettet heterogenitet, kan graden av Diffraksjon mønster forvrengning være korrelert med prosentandelen av fetal hemoglobin i blodet av pasienter med sigd celle anemi. ¹⁰ flere osmotisk gradient ektacytometry parametere er likeledes korrelert med andelen fosterets eller sickle hemoglobin i blodet fra pasienter med sigd celle anemi. Diffraksjon mønster forvrengning sammenhenger sannsynligvis gjenspeiler bidrag av hemoglobin sammensetning stive, ikke-deformerbare celler prosenten. Ytterligere rundt gjennomgår hele osmotisk gradient ektacytometry profilen bifasisk endringer som tilsvarer andelen tette celler i sirkulasjon under sigd celle krisen. ¹¹

Ektacytometry er også nyttig i studiet av flere andre lidelser. Osmotisk gradient ektacytometry er diagnostiske for arvet røde celle membran lidelser, som arvelig spherocytosis, arvelige elliptocytosis og arvelige pyropoikilocytosis. ^{3 , 12 , 13 , 14} reduseres deformability oppstår i jernmangel. ¹⁵ karakteristikk av “lagring lesjonen” blod har ansatt ektacytometry og fremtidige studier undersøker både natur lesjonen og risikoreduksjon dannelsen under lagring av banked blod er sannsynlig å dra nytte av den teknikker som presenteres her. ¹⁶ reduseres røde celle deformability har også vært korrelert med mikrovaskulær sykdom i diabetes. ¹⁷ nyere studier knytte hyperglykemi, røde celle ascorbate konsentrasjoner og osmotisk skjørhet tyder disse faktorer kan være viktige i utviklingen av mikrovaskulær sykdom. ¹⁸ Ektacytometry studier er nå underveis for å undersøke denne hypotesen (Parrow og Levine, upubliserte data). Blod scenen malarial infeksjon er en annen interessant avenue røde celle deformability undersøkelser. Mobilnettet deformability av Plasmodium falciparum infisert røde blodlegemer reduseres dramatisk i løpet av 48 timer av intracellulær modning av parasitten ring scenen schizont scenen. Bevis indikerer at denne redusert deformability tilbakeføres ved modning av parasitten. Reversering sammenfaller med utgivelsen av infiserte røde celler i sirkulasjonen. Redusert deformability antas å være formidlet av Plasmodium proteiner som fremmer lagring av red cellen. ¹⁹ disse studiene representerer et lite utvalg av klinisk viktige forhold der måling røde blodlegemer deformability og osmotisk gradient parametere er relevante. Det finnes flere flere områder av studien.

Alternative teknikker for måling av røde celle deformability inkluderer optiske pinsett (også kjent som laser feller) som bruker fysiske egenskaper av fotoner for å strekke enkelt røde celler i én eller flere retninger. ²⁰ denne teknikken har fordelen av å måle deformability av enkelt erytrocytter, men noen usikkerhet i kraft kalibrering har produsert betydelig variasjon over studier ²¹ og dataanalyse kan være arbeidskrevende med mindre automatisert. ²² brønnene aspirasjon, som bruker negative trykket inneholder en røde blodlegemer i brønnene, har også blitt brukt til å måle deformability av røde celler. ^{7 , 23} flere målinger, som presset kreves for å Sug opp den røde cellen, er mulig med hvert mål definere ulike egenskaper for red cellen. ²³ atomic force mikroskopi er en høy oppløsning teknikk som måler membran stivhet av kvantifisere laser strålen nedbøyning som indikator av cantilever nedbøyning langs overflaten av en rød-celle. ²⁴ disse teknikkene gir informasjon om individuelle erytrocytter, ikke er tilpasset enkelt for å måle endringer bestander av røde blodceller, og generelt krever omfattende tekniske ekspertise.

Lyst til å prøve både individuelle og grupper av celler samtidig har ført til fremskritt innen automatisering og utvikling av microfluidics og matrise-baserte metoder. Som ektacytometry, rheoscopy måler deformability som en funksjon av skjæring stress, men bildene er ervervet direkte via mikroskop. ²⁵ for høyere lakkeringsverksteder analyser, automatisert celle bildebehandling har vært ansatt å produsere deformability distribusjoner bruke rheoscope. ²⁶ cellular heterogenitet kan kvantifiseres ved denne metoden hvis data fra en sunn kontroll faget. ²⁷ Microfluidics teknikker også gi rom for høy lakkeringsverksteder analyser av enkeltceller; flere design med tilpasninger av filtrering,²⁸ celle transitt analyserer,²⁹ som måler tiden som kreves for en røde blodlegemer flyt gjennom en micropore og alternativer som måler trykket nødvendig for røde blodlegemer transitt heller enn tiden ³⁰ er utviklet. En annen plattform for høy lakkeringsverksteder analyse av individuelle celler er enkelt celle microchamber matrise chip, som har fordelen av muliggjør nedstrøms fluorescens-baserte karakteristikk av cellene. ³¹ selv om hver av disse teknikkene er potensielt nyttig og kan være overlegen for bestemte programmer, den komparative fortrinn i ektacytometry inneholder følsomhet, brukervennlighet, og presisjon. ³² siste generasjon av kommersielt tilgjengelige ektacytometers har betydelig allsidighet av analyser som kan utføres.

Protocol

Alle fag i denne studien ga skriftlig samtykke i henhold til erklæringen i Helsinki og nasjonale institutter for helse institusjonelle Review Board godkjent protokollene. 1. slå på ektacytometer Koble slangen fra rengjøringsmiddel til lav og høy osmolar polyvinylpyrrolidone (PVP) løsninger. Pass på å koble 0 osmolar røret til lav osmolar løsning og 500 osmolar røret til høy osmolar løsning.Merk: Lav osmolar PVP løsningen bør ha en osmolality mellom…

Representative Results

Ektacytometry resultatene som beskrives i dette manuskriptet kan brukes til å måle røde celle deformability i en tilstand. En skjematisk av generelle satt opp av en ektacytometer er vist i figur 1. Homogen bestander av erytrocytter vil produsere en elliptisk Diffraksjon mønster som svar på økende skjæring stress som kan brukes til å beregne forlengelse indeksen som vist i figur 2. Diffraksjon mønster forvrengningen forek…

Discussion

Ektacytometry teknikkene er enkle og godt automatisert, sikre lovlig og reproduserbar resultater. Likevel, noen viktige trinn finnes. Riktig temperaturkontroll blod er viktig. Lagring ved romtemperatur i mer enn åtte timer kan påvirke SS ½ verdier. ³⁴ sikre at temperaturen på maskinen er stabilt på 37 ° C er også viktig, som viskositet av suspending medium er temperaturen avhengige. Blod skal være fullt oksygenert for å unngå redusert deformability som følge av ikke-oksygenert eller del…

Materials

LoRRca MaxSis standard version	Mechatronics	LORC109000
LoRRca MaxSis Osmoscan	Mechatronics	LORC109001
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm	Mechatronics	QRR030910
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm	Mechatronics	QRR030930
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials	Mechatronics	QRR030901
X clean	Mechatronics	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 filter tips	MidSci	AV200-H
P1250 filter tips	MidSci	AV1250-H
Kimwipes	MidSci	8091
1.5 mL eppendorf tubes	MidSci	AVSS1700
15 mL conical vial	MidSci	C15R