Mäta Deformability och Red Cell heterogenitet i blod av Ektacytometry

Summary

Här presenterar vi tekniker för att mäta röd cell deformability och cellulära heterogenitet av ektacytometry. Dessa tekniker är tillämpliga allmänna utredningar av röda blodkroppar deformability och särskilda undersökningar av blodsjukdomar som kännetecknas av förekomsten av både styv och deformerbara erytrocyter i cirkulationen, såsom sickle-cell anemi.

Abstract

Minskad röd cell deformability är kännetecknande för flera sjukdomar. I vissa fall kan omfattningen av defekta deformability förutsäga svårighetsgraden av sjukdomen eller förekomsten av allvarliga komplikationer. Ektacytometry använder laser diffraktion viscometry för att mäta deformability av röda blodkroppar föremål för antingen ökande skjuvspänningen eller en osmotisk gradient på ett konstant värde på tillämpad skjuvspänning. Direkt deformability mätningar är dock svåra att tolka vid mätning heterogen blod som kännetecknas av förekomsten av både styv och deformerbara erytrocyter. Detta beror på stela celler oförmåga att korrekt anpassa svar skjuvspänning och resulterar i en förvrängd diffraktionsmönster som kännetecknas av en överdriven minskning av uppenbara deformability. Mätning av graden av snedvridning ger en indikator av heterogenitet i erytrocyter i blodet. I sickle-cell anemi, är detta korrelerade med den procentandel av styv celler, som återspeglar hemoglobin koncentrationen och hemoglobin sammansättningen av erytrocyterna. Förutom att mäta deformability, ger osmotisk gradient ektacytometry information om osmotisk bräcklighet och vätskestatus av erytrocyter. Dessa parametrar också återspegla hemoglobin sammansättningen av röda blodkroppar från sickle cell patienter. Ektacytometry mäter deformability hos populationer av erytrocyter och ger inte, därför information på deformability eller mekaniska egenskaper hos enskilda erytrocyter. Oavsett, är målet av de tekniker som beskrivs häri att ge en bekväm och pålitlig metod för att mäta deformability och cellulära heterogenitet av blod. Dessa tekniker kan vara användbara för att övervaka tidsmässiga förändringar, samt sjukdomsprogression och respons till terapeutisk intervention i flera sjukdomar. Sickle cell anemi är en välkarakteriserad exempel. Andra potentiella störningar där mätningar av röda blodkroppar deformability eller heterogenitet är av intresse inkluderar blod lagring, diabetes, Plasmodium infektion, järnbrist och de hemolytisk anemier på grund av membranet brister.

Introduction

Ektacytometry ger en bekväm mått på röda blodkroppar deformability som svar på förändringar i skjuvspänning (mäts i Pascal (Pa)) eller upphäva medium osmolalitet. Relevanta parametrar för röda blodkroppar deformability inkluderar maximal töjning index (EI Max), ett mått på den maximala deformability för en röd cell som svar på ökad skjuvspänning och skjuvspänning ½ (SS ½), krävs för att uppnå halva maximala skjuvspänningen deformability. ¹ osmotisk gradient ektacytometry har flera informativa parametrar. Dessa inkluderar töjning indexet minsta (EI Min), ett mått på ytan till volym baserat och osmolalitet då det sker (O Min), vilket är ett mått på osmotisk bräcklighet. EI Max och osmolalitet då det sker (O (EI Max)) ger information om membran flexibilitet och cell yta. Halva maximal töjning i hyperton armen av den osmotiska gradienten representeras av EI hyper. EI hyper och osmolalitet som det uppstår, O hyper, ger information om intracellulära viskositeten av röda cellen som bestäms av hemoglobin koncentrationen. ^{2 , 3} mäta deformability i heterogen blod kompliceras av det faktum att styva celler, såsom sickled röda blodkroppar, inte justeras korrekt med flödesriktningen såsom deformerbara celler som svar på ökad skjuvspänning. I stället för att producera en karakteristiska elliptiska diffraktion bild, producerar styv celler ett sfäriskt mönster vilket resulterar i en diamant-formade diffraktionsmönster när överdrog på ellipsen produceras av deformerbara celler. ^{4 , 5 , 6} det sfäriska mönstret har visat sig motsvara irreversibelt sickled celler genom att utföra ektacytometry på isolerade fraktioner av celler efter densitet centrifugering. ⁶ töjning indexberäkning omfattar åtgärder för både långa och korta axeln av ellipsen; en diamantform därför producerar en uppenbar minskning av töjning genom att öka bredden på den korta axeln. ⁷ det har tidigare visat att graden av diffraktion mönster distorsion är korrelerade med både andelen skäran hemoglobin (HbS) och procentandelen av sickled celler i blodet från patienter med sicklecellanemi. ⁵ graden av diffraktion mönster snedvridning kan erhållas av komplexa matematiska analyser. ⁸ det kan också erhållas genom att justera öppningen av kamerans bländare på ektacytometer eller den grå nivån av programvaran montering att ändra höjden diffraktion mönster. ⁵ dock information om hur du justerar den grå nivån är inte väldefinierade och kameran bländaren är inte lättillgänglig på den senaste generationen av de kommersiellt tillgängliga ektacytometer. För att kringgå dessa frågor, kan lättillgängligt kamera vinsten användas för att justera diffraktion mönster höjder. ⁹ med den här metoden för att uppskatta cellulära heterogenitet, kan graden av diffraktion mönster snedvridning korreleras med procentandelen av fetalt hemoglobin i blodet hos patienter med sickle-cell anemi. ¹⁰ flera osmotisk gradient ektacytometry parametrar är jämväl korrelerade med procentandelen av fostrets eller skäran hemoglobin i blod från patienter med sicklecellanemi. Diffraktion mönster distorsion korrelationer sannolikt återspeglar bidraget av hemoglobin sammansättning till procentandelen av styva, icke-deformerbara celler. Ytterligare sevärdheter genomgår hela osmotisk gradient ektacytometry profilen bifasisk förändringar som motsvarar procentandelen av täta celler i omlopp under sicklecellkris. ¹¹

Ektacytometry är jämväl användbar i studiet av flera andra sjukdomar. Osmotisk gradient ektacytometry är diagnostiska för de ärvda röd cell membran sjukdomar, såsom ärftlig spherocytosis, ärftlig elliptocytosis och ärftliga pyropoikilocytosis. ^{3 , 12 , 13 , 14} sänkt deformability uppstår i järnbrist. ¹⁵ karakterisering av ”lagring lesionen” av blod har anställd ektacytometry och framtida studier som undersöker både arten av lesionen och interventioner för att förhindra dess bildning under lagringen av bankas blod sannolikt att dra nytta av den tekniker presenteras här. ¹⁶ minskad röd cell deformability har också korrelerats med mikrovaskulära sjukdomen diabetes. ¹⁷ senaste studier länka hyperglykemi, röd cell askorbat koncentrationer och osmotisk bräcklighet tyder dessa faktorer kan vara viktiga i utvecklingen av mikrovaskulära sjukdomar. ¹⁸ Ektacytometry studier pågår för närvarande att undersöka denna hypotes (Parrow och Levine, opublicerade data). Blodet steg malarial infektion är en annan intressant avenue röd cell deformability utredningar. Cellulär deformability av Plasmodiumfalciparum infekterade röda blodkroppar minskar dramatiskt under de 48 timmarna av intracellulära mognaden av parasiten från ringen scenen schizont scenen. Uppgifter tyder på att detta minskad deformability är omvänd vid mognaden av parasiten. Återföringen sammanfaller med lanseringen av infekterade erytrocyter i cirkulationen. Minskad deformability tros vara medierade av Plasmodium proteiner som främjar upptag av den röda blodkroppar. ¹⁹ dessa studier representerar ett litet urval av kliniskt viktiga villkor där mäta erytrocyt deformability och osmotisk gradient parametrar är relevanta. Finnas flera ytterligare områden av studien.

Alternativa tekniker för att mäta röd cell deformability inkluderar optisk pincett (även känd som laser fällor) som använder de fysiska egenskaperna av fotoner för att sträcka enda röda blodkroppar i en eller flera riktningar. ²⁰ denna teknik har fördelen av att mäta deformability av enda erytrocyter, men viss osäkerhet i kraft kalibrering har producerat betydande variabilitet över studier ²¹ och dataanalys kan vara arbetsintensiva såvida inte automatiserad. ²² mikropipett aspiration, som använder undertryck som aspirerar en erytrocyt till en mikropipett, har också använts för att mäta deformability röda blodkroppar. ^{7 , 23} flera mätningar, såsom de påtryckningar som krävs för att aspirera röd cellen, är möjligt med varje åtgärd som definierar olika egenskaper hos de röda blodkroppar. ²³ atomic force microscopy är en högupplöst teknik som mäter membran stelhet av kvantifiera laser beam omläggning som indikator av fribärande omläggning längs ytan av en röd cell. ²⁴ dessa tekniker ge information om enskilda erytrocyter, är inte enkelt anpassade för att mäta förändringar i populationer av röda blodkroppar, och, i allmänhet kräver betydande tekniska sakkunskap.

Önskan att prova både individ och populationer av celler samtidigt har lett till framsteg inom automation och utvecklingen av mikrofluidik och arraybaserade metoder. Som ektacytometry, rheoscopy mäter deformability som en funktion av shear stress men bilder förvärvas direkt via Mikroskop. ²⁵ för högre genom-satte analyser, automatiserade cell imaging har varit anställd att producera deformability-distributioner som använder rheoscope. ²⁶ cellulära heterogenitet kan kvantifieras genom denna metod om data från en frisk kontroll ämne är tillgängliga. ²⁷ mikrofluidik tekniker också möjliggör hög genom-satte analyser av enstaka celler; flera mönster med hjälp av anpassningar av filtrering,²⁸ cell transit analysatorer,²⁹ , som mäter den tid som krävs för en erytrocyt flödet genom en mikaeljacobsson och alternativ som mäter trycket krävs för erytrocyt transit snarare tid ³⁰ har utvecklats. En annan plattform för hög genom-satte analys av enskilda celler är enda cell microchamber array chipet, som har den ytterligare fördelen att för nedströms fluorescens-baserade karaktärisering av cellerna. ³¹ även om var och en av dessa tekniker är potentiellt användbara och kan vara överlägsen för särskilda applikationer, inkluderar de komparativa fördelarna ektacytometry känslighet, användarvänlighet, och precision. ³² den senaste generationen av kommersiellt tillgängliga ektacytometers också äger betydande mångsidighet i antalet analyser som kan utföras.

Protocol

Alla försökspersonerna i denna studie gav skriftligt informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen och nationella institut för hälsa institutionella Review Board godkända protokoll. 1. slå på ektacytometer Anslut slangen från rengöringslösningen till de låga och höga osmolaritetssystem polyvinylpyrrolidon (PVP) lösningarna. Var noga med att ansluta 0 osmolaritetssystem röret till lågosmolärt lösningen och 500 osmolaritetssystem röret till hög osmolari…

Representative Results

Ektacytometry resultaten beskrivs i detta manuskript kan användas för att mäta röd cell deformability i alla. En schematisk bild av den allmänna uppbyggnaden av ett ektacytometer visas i figur 1. Homogen populationer av erytrocyter kommer att producera en elliptisk diffraktionsmönster som svar på ökad skjuvspänning som kan användas för att beräkna indexet töjning som visas i figur 2. Diffraktion mönster distorsion u…

Discussion

Ektacytometry metoder som beskrivs är enkel och väl automatiserade, att säkerställa giltig och reproducerbara resultat. Dock finns vissa kritiska moment. Rätt temperaturkontroll av blod är viktigt. Lagring i rumstemperatur mer än åtta timmar kan påverka SS ½ värden. ³⁴ att säkerställa att temperaturen i maskinen är stabil vid 37 ° C är också viktigt, som av det uppskjutande mediet viskositet är temperaturberoende. Blodet bör vara fullt syresatt för att undvika minskad deformabi…

Materials

LoRRca MaxSis standard version	Mechatronics	LORC109000
LoRRca MaxSis Osmoscan	Mechatronics	LORC109001
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm	Mechatronics	QRR030910
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm	Mechatronics	QRR030930
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials	Mechatronics	QRR030901
X clean	Mechatronics	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 filter tips	MidSci	AV200-H
P1250 filter tips	MidSci	AV1250-H
Kimwipes	MidSci	8091
1.5 mL eppendorf tubes	MidSci	AVSS1700
15 mL conical vial	MidSci	C15R