एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए एकाधिक, अंतर्जात पोस्ट-शोधों संशोधनों की जांच करना बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है । तकनीक यहां वर्णित एक अनुकूलित lysis बफर और फ़िल्टर विशिष्ट PTM-लक्ष्यीकरण, संबध मैट्रिक्स के साथ विकसित प्रणाली का उपयोग acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, और एक लक्ष्य के लिए tyrosine फास्फारिलीकरण संशोधनों का पता लगाने के लिए प्रोटीन एक एकल, सुव्यवस्थित प्रणाली का उपयोग कर ।
अब यह अच्छी तरह से सराहना की है कि बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) एक प्रोटीन की संरचना और समारोह है, जो एक दिया है प्रोटीन की भूमिका दोनों शारीरिक और रोग के लिए आवश्यक हो सकता है विनियमित में एक अभिंन भूमिका निभाते हैं । PTMs के संवर्धन अक्सर आवश्यक है जब एक लक्ष्य प्रोटीन की PTM स्थिति की जांच, क्योंकि PTMs अक्सर क्षणिक और अपेक्षाकृत कम बहुतायत में हैं । कई नुकसान का सामना कर रहे है जब एक लक्ष्य प्रोटीन की एक PTM के लिए समृद्ध, ऐसे बफर असंगति के रूप में, लक्ष्य प्रोटीन एंटीबॉडी आईपी संगत नहीं है, PTM संकेत की हानि, और दूसरों । कठिनाई की डिग्री बढ़ाया है जब acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 की तरह कई PTMs की जांच, और tyrosine फास्फारिलीकरण एक दिया लक्ष्य प्रोटीन के लिए । इन PTMs का एक संयोजन का अध्ययन आवश्यक हो सकता है, के रूप में PTMs के बीच crosstalk प्रचलित है और प्रोटीन विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है । अक्सर, इन PTMs अलग lysis बफ़र्स में और अद्वितीय अवरोध करनेवाला रचनाओं के साथ अध्ययन कर रहे हैं. इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, एक अद्वितीय denaturing lysis प्रणाली विकसित की गई थी जो इन चार PTMs को प्रभावी ढंग से अलग और संरक्षित करती है; इस प्रकार, एक एकल lysis प्रणाली में संभावित crosstalk की जांच को सक्षम करने के । एक अनूठा फिल्टर प्रणाली lysate से दूषित जीनोमिक डीएनए को दूर करने के लिए इंजीनियर था, जो एक समस्याग्रस्त द्वारा-उत्पाद denaturing बफ़र्स है । मजबूत संबध मैट्रिक्स लक्ष्यीकरण चार PTMs में से प्रत्येक के लिए इन चार PTMs के अंतर्जात राज्यों के संवर्धन और पता लगाने को अधिकतम करने के लिए बफर प्रणाली के साथ संगीत कार्यक्रम में विकसित किया गया । यह व्यापक PTM डिटेक्शन toolset एक प्रोटीन एक या अधिक इन PTMs के द्वारा संशोधित किया गया है कि क्या के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने की प्रक्रिया को सरल ।
बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) अत्यधिक एक प्रोटीन के लिए परिवर्तन विनियमित रहे हैं, जिससे संशोधन जोड़ा है या एक विशिष्ट तरीके से हटा दिया । PTMs अक्सर गतिशील हैं, परिवर्तनीय परिवर्तन है कि काफी प्रोटीन की संरचना को बदलने, साथी प्रोटीन के साथ बातचीत, और स्थानिक स्थानीयकरण, और अंत में प्रोटीन को सक्षम करने के लिए विशिष्ट कार्य प्रदर्शन1,2 , 3 , 4. PTMs इतनी प्रचुर मात्रा में है कि वे लगभग ३०,००० जीन उत्पादों से अद्वितीय प्रोटीन रूपों (या proteoforms) की संख्या में वृद्धि एक लाख proteoforms5,6से अधिक है । पहचान PTMs और एक लक्ष्य प्रोटीन पर उनके प्रभाव को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है प्रोटीन शारीरिक और रोग कार्यों को समझने की7,8,9,10, 11,12,13,14. tubulin, p53, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (EGFR) जैसे चुनिंदा प्रोटीन पर काम PTMs15,16,17की विनियामक भूमिकाओं का आविर्भाव हुआ है । इन अध्ययनों से तथ्य यह है कि इन प्रोटीन का विनियमन कई PTMs द्वारा होता है उजागर, और कई मामलों में इन संशोधनों संगीत कार्यक्रम में काम करने के लिए एक विशिष्ट समारोह को बढ़ावा देने के । नए अध्ययनों से पता चला है कि दोनों सहकारी और नकारात्मक PTM crosstalk कई अलग प्रोटीन पर हो सकता है18,19,20,21,22, 23,24,25. हालांकि, प्रोटीन के बहुमत के PTM प्रोफाइल कई अध्ययनों कि विभिंन मॉडलों और अद्वितीय शर्तों का इस्तेमाल किया है से निर्मित कर रहे हैं । एक अनुकूलित प्रणाली के बाद एक प्रणाली में कई PTMs की जांच करने के लिए अत्यधिक संभावित PTM crosstalk में एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अंतर्दृष्टि हासिल लाभप्रद होगा ।
एक ही सिस्टम में PTMs जांच के साथ एक चुनौती है कि विशिष्ट PTMs अलग lysis बफ़र्स का उपयोग कर जांच कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, RIPA या NP-४० जो सामान्यतः फास्फारिलीकरण या ubiquitination जाँच के लिए उपयोग किए जाते हैं जैसे बफ़र्स का उपयोग छोटे PTM जैसे संशोधक (सुमो) ubiquitin26की तरह एक labile ylation का अध्ययन करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है । साथ ही, गैर-denaturing बफ़र्स dissociating प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए अपर्याप्त हैं, और गलत धनात्मक PTM पहचान के लिए लीड कर सकते हैं27। एक denaturing lysis बफर में PTMs की जांच पसंद किया जा सकता है, के रूप में यह काफी बेहतर है सभी सेलुलर डिब्बों से प्रोटीन अलग करने में28, अलग सबसे प्रोटीन बातचीत करेंगे, और रोकना होगा कि इस तरह के रूप में बदल PTM राज्यों, deSUMOylases 26; हालांकि, denaturing बफ़र्स जैसे ubiquitin बाइंडिंग डोमेन-आधारित उपकरण27विशिष्ट समानता reagents की अक्षतता compromise हो सकता है । एक denaturing की तरह lysis प्रणाली का विकास एक समानता एजेंट में एक प्रोटीन के कई PTMs अध्ययन संगत प्रणाली PTM crosstalk जांच के लिए अत्यधिक लाभकारी होगा ।
हालांकि denaturing बफ़र्स PTMs की जांच के लिए गैर-denaturing बफ़र्स पर मुख्य लाभ है, वे कम सामांयतः उनके महत्वपूर्ण कमियां, जैसे पारंपरिक प्रोटीन परख के साथ असंगति के रूप में उपयोग किया जाता है, महत्वपूर्ण जीनोमिक deoxyribonucleic एसिड (DNA) संदूषण, और व्यवधान immunoprecipitation (IP) के लिए29। ये कमियां विस्तारित तैयारी के समय और संभावित नुकसान में परिणाम कर सकते है प्रोटीन लक्ष्य जब जीनोमिक डीएनए कतरनी । दो आमतौर पर इस्तेमाल किया कतरनी डीएनए के तरीके सिरिंज lysis और sonication29शामिल हैं । दोनों तरीकों व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता है और अक्सर सटीक reproducibility कमी । जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए वैकल्पिक तरीकों DNAses के अलावा शामिल हैं; हालांकि, यह अतिरिक्त ऑप्टिमाइज़ेशन और बफ़र संरचना में परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है । अंततः, एक सरल और प्रतिलिपि विधि जीनोमिक डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए फायदेमंद होगा जब PTM जांच के लिए denaturing lysis बफ़र्स के साथ काम कर रहा है ।
इस तकनीक के लक्ष्य को अलग करने और जांच ubiquitination (यूबी), tyrosine फास्फारिलीकरण (pY), SUMOylation 2/3 (सूमो 2/3), और acetylation (Ac) PTMs एक एकल प्रणाली में एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए PTM crosstalk की बेहतर जांच करने के लिए एक प्रणाली विकसित करने के लिए है । इस PTM डिटेक्शन सिस्टम को तेजी से जांचने के लिए उपयोग किया गया था अंतर्जात PTM प्रोफाइल को एक ही सिस्टम में कई टारगेट प्रोटीन्स की । संभावित crosstalk में नई अंतर्दृष्टि30,31की पहचान की थी । कुल मिलाकर, तकनीक यहां वर्णित मौजूदा तरीकों पर सुधार के लिए तीन अलग तरीकों से PTMs और PTM crosstalk की जांच: 1) एक अद्वितीय denaturing बफर विकसित किया गया था कि सभी सेलुलर डिब्बों से प्रोटीन अलग, जबकि अभी भी साथ संगत किया जा रहा PTM संबध रिएजेंट, 2) एक अनूठा फिल्टर प्रणाली विकसित की है कि तेजी से उच्च reproducibility के साथ विकृत lysates से जीनोमिक डीएनए संदूषण निकालता है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और 3) मजबूत संबंध मोती, lysis प्रणाली, और निरोधात्मक रिएजेंट संगत हैं; इस प्रकार, PTM संवर्धन को अधिकतम करने के लिए एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए इन चार PTMs के अलगाव को सरल बनाने, और कुशलता से संभावित crosstalk की जांच ।
प्रारंभिक यदि एक लक्ष्य प्रोटीन एक PTM द्वारा संशोधित किया गया है निर्धारित करने के लिए उपयोग लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है आईपी, एक PTM एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी दाग के बाद (उदा, विरोधी एसिटाइल lysine), या ip के लिए एक PTM एंटीबॉडी का उपयोग करके, लक्ष्य प्रोटीन के साथ पश्चिमी दाग के बाद विशिष्ट एंटीबॉडी30,31,३३। हालांकि दोनों दृष्टिकोण सैद्धांतिक रूप से काम करते हैं, एक लक्ष्य का उपयोग-प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी अधिक संभावित नुकसान है, जैसे एंटीबॉडी आईपी संगत नहीं हो सकता है, या बड़े PTM संशोधनों लक्ष्य पर एंटीबॉडी मांयता साइट ब्लॉक कर सकते है प्रोटीन३४ ,३५. PTM संबध मोतियों का लाभ यह है कि एंटीबॉडी या बंधन डोमेन विशेष रूप से ब्याज की PTM पहचान; इस प्रकार, लक्ष्य प्रोटीन के संशोधन समानता मोतियों द्वारा मांयता बदल नहीं करना चाहिए । उदाहरण के तौर पर यहां वर्णित तकनीक के साथ पीडी-L1 यूबी की पहचान की गई, और दोनों अंतर्जात मोनो-और पॉली-यूबी को देखा गया (चित्रा 4) । लिम एट अलद्वारा हाल ही में एक प्रकाशन । इन विट्रो यूबी तकनीक में उपयोग पीडी-L1 यूबी की जांच करने के लिए, और परिणाम बहुत चित्रा 4३६में दिखाया परिणाम के समान था । दिलचस्प है, वे भी एक पीडी-L1 एंटीबॉडी के साथ आईपी प्रदर्शन सेल lysate से पीडी-L1 को समृद्ध करने के लिए, जहां यूबी व्यक्त किया गया था और एमजी-१३२ संकेत बढ़ाने के लिए जोड़ा गया था. यूबी पैटर्न दमदार नहीं था और इन विट्रो यूबी पैटर्न में से बहुत अलग है । सेल कल्चरल मॉडल्स में अंतर्जात पीडी-L1 यूबी की जांच स् लिम एट अलमें नहीं की गई । अपने सेल कल्चर और इन विट्रो डेटा के बीच अंतर को स्पष्ट करने के लिए रिपोर्ट करें ।
जांच कर रहा है कि क्या एक प्रोटीन एक PTM द्वारा संशोधित किया गया है चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसकी कम बहुतायत और क्षणिक प्रकृति के कारण३७,३८, और अक्सर आईपी के माध्यम से संवर्धन की आवश्यकता है । PTMs के प्रभावी IP कई प्रमुख चरणों और reagents, जैसे lysis बफ़र्स और संबध reagents के ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता है । जब एक लक्ष्य प्रोटीन के कई PTMs की जांच, आवश्यक अनुकूलन की संभावना बढ़ जाती है । blastR lysis प्रणाली का उपयोग इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है, के रूप में यह मजबूत आईपी क्षमता का कहना है, जबकि pY, सूमो 2/3, यूबी, और एक एकल प्रणाली में एसी PTMs के PTM का पता लगाने को सक्षम करने से । इस तकनीक का समय और अगर एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन इन चार PTMs द्वारा संशोधित किया गया है निर्धारित करने के लिए आवश्यक संसाधनों का अनुकूलन, और संभावित PTM परिणामों की तुलना में एकाधिक lysis प्रणालियों का उपयोग कर प्रदर्शन के सापेक्ष crosstalk PTM की एक बेहतर तस्वीर प्रदान करता है । ग्लाइकोसिलेशन की तरह वैकल्पिक PTMs के साथ blastR lysis प्रणाली की अनुकूलता की जांच की गई; हालांकि, सभी प्रकार के PTMs के लिए exhaustively की जांच नहीं की गई है ।
प्रचुर जीनोमिक डीएनए या तो वर्णमिति या nanodrop तरीकों का उपयोग प्रोटीन माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, एक एसडीएस acrylamide जेल में प्रोटीन के प्रवास को प्रभावित, और आईपी परख के दौरान प्रोटीन और संबध मैट्रिक्स बातचीत को रोकने के । विधि यहां वर्णित एक विशेष फिल्टर का इस्तेमाल प्रभावी ढंग से जीनोमिक डीएनए संदूषण, जो इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है हटाने के लिए । इस बिंदु को हाइलाइट करने के लिए, चिपचिपापन परीक्षण से पहले और blastR फिल्टर उपचार के बाद प्रदर्शन किया गया, और परिणाम पानी की चिपचिपाहट के लिए एक उच्च चिपचिपापन से एक कमी दिखाया (डेटा नहीं दिखाया गया है) । चिपचिपापन में यह परिवर्तन चित्रा 3में परिणाम के द्वारा समर्थित किया गया था, लगभग सभी जीनोमिक डीएनए दिखा हटा दिया गया था । महत्वपूर्ण बात, डीएनए इस विधि के साथ कतरनी नहीं है, के रूप में किसी भी कतरनी डीएनए फिल्टर द्वारा कब्जा नहीं किया जाएगा (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस उपकरण के पारंपरिक तरीकों से बेहतर है, sonication या सिरिंज-डीएनए-बाल काटना की तरह, क्योंकि यह कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, अत्यधिक प्रतिलिपि है, और डीएनए के बजाय यह कतरनी निकालता है । इसके अलावा, यह lysate में प्रोटीन नीचा नहीं है, जो पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर सकते है29हो जाएगा । फिल्टर का उपयोग नमूना प्रति 5-30 सेकंड लेता है वैकल्पिक तरीकों की तुलना में जहां डीएनए के प्रभावी टूटने कई मिनट लग सकते हैं(अर्थात, सिरिंज बाल काटना) और डीएनए विविधता में परिणाम के रूप में lysate में रहना कर सकते हैं । lysate पूर्व और पोस्ट-blastR फ़िल्टरिंग का व्यापक विश्लेषण किया गया था, और प्रोटीन प्रोफ़ाइल में कोई चौकस अंतर Coomassie, लक्ष्य विशेष पश्चिमी, या कुल और लक्ष्य विशेष PTM विश्लेषण द्वारा मनाया गया; इस प्रकार, प्रोटीन प्रोफ़ाइल की अखंडता बाहर जीनोमिक डीएनए को छानने से प्रभावित नहीं किया गया है हो सकता है । अंततः, इस फिल्टर प्रणाली किसी भी पश्चिमी या आईपी आवेदन जहां जीनोमिक डीएनए मौजूद है और प्रोटीन विश्लेषण की व्याख्या को प्रभावित कर सकते है के लिए फायदेमंद है ।
यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि वहां झूठी नकारात्मक इस तकनीक है, जो भाग में संबंध मनका संतृप्ति, बाध्यकारी साइट हस्तक्षेप, या PTM मास्किंग के कारण हो सकता है का उपयोग पता लगाने के लिए क्षमता है । उदाहरण के लिए, एक विशेष लक्ष्य प्रोटीन बहुत कम स्तर पर एसी द्वारा संशोधित किया जा सकता है; इस प्रकार, यह पैन द्वारा अलग नहीं किया जा सकता है-एसिटाइल lysine संबंध मोती है कि और अधिक प्रचुर मात्रा में एसी संशोधित लक्ष्य प्रोटीन द्वारा संतृप्त किया गया है । चल रहे अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग संबध रिएजेंट का पता लगाने की सीमा का आकलन किया जा रहा है, लेकिन हाल ही में एक प्रकाशन एक बहुत मजबूत पता लगाने की सीमा का पता चलता है । आंकड़ों से पता चला है कि इस तकनीक के रूप में कुछ के रूप में 17 acetylated लक्ष्य प्रति सेल31प्रोटीन अणुओं की पहचान सकता है । फिर भी, विशिष्ट उत्तेजनाओं के रूप में कोशिका प्रकार विशिष्टता, क्षणिक PTMs, या प्रोटीन बातचीत के कारण PTMs के मास्किंग के रूप में विशिष्ट परिस्थितियों में सभी परिणाम गलत नकारात्मक परिणाम हो सकता है । ये इस तकनीक का संभावित नुकसान कर रहे हैं, साथ ही साथ सबसे PTM आईपी तरीकों । इस प्रकार, यह एकाधिक दृष्टिकोण का उपयोग कर परिणामों की पुष्टि की सिफारिश की है ।
ग्लाइकोसिलेशन और फास्फारिलीकरण तरह संशोधनों के लिए इसी तरह अमीनो एसिड के लिए प्रतिस्पर्धा दिखाया गया है३९,४०, और ubiquitination और फास्फारिलीकरण जैसे अंय PTMs के लिए क्रमिक रूप से काम करने के लिए एक प्रोटीन को विनियमित दिखाया गया है समारोह17,४१। neuropathological प्रोटीन तौ पर हाल ही में काम PTM crosstalk के महत्व पर प्रकाश डाला, जहां ताऊ हाइपर-फास्फारिलीकरण और ताऊ SUMOylation एक दूसरे को बढ़ाकर४२। इसके अलावा, इस समूह से पता चला कि ताऊ के SUMOylation ने पाली-यूबी और उसके बाद ताऊ के क्षरण को रोका, संभवत: एकत्रीकरण में अग्रणी । यह सिर्फ नियामक PTM crosstalk के कई उदाहरणों में से एक है, और इस तकनीक की उपयोगिता के स्वास्थ्य और रोग में प्रमुख प्रोटीन को विनियमित करने में PTMs और उनके crosstalk के महत्व को रोशन करने में मदद मिलेगी ।
The authors have nothing to disclose.
हम धंयवाद Cytoskeleton इंक अनुसंधान वैज्ञानिकों और डीआरएस । ब्रायन हूवर और एशले डेविस उनके महत्वपूर्ण समीक्षा, संपादन, और पांडुलिपि पर उपयोगी विचार विमर्श के लिए । इसके अतिरिक्त, हम वीडियो पांडुलिपि के उत्पादन के दौरान उनके योगदान के लिए डॉ रॉबर्ट Hom धंयवाद । यह काम Cytoskeleton इंक से फंडिंग द्वारा समर्थित था ।
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
cell scrapers | Costar | 3008 | |
BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
PTM Immunoprecipitation | |||
Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
Cell growth and treatment | |||
Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |