Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.
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방법 논문
트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands
이 논문에서
요약
초록
노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 > 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.
서론
정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands1간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화2. 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지3. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치4신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]5. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에....
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프로토콜
1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비
- 제품의 PCR 증폭
- 야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분).
녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')-
앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')-
앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
- 야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분).
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결과
우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands8. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 사용 되었다. 최저 (KD)의 실시간 PCR에 의해 시험 되었다 그리고 808보다 큰 수를 표시 했다. 그런 다음 트랜스와 노치 수용 체의 바인딩을-shams KD 집계 분석 실험을 사용 하 여 조사 되었다 시 델타. S2-노치와 S2-델타 세포 사이 집계는 그들을 혼합 .......
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토론
정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands5간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한정자의 영향을 기본 메커니즘을 해독, 그것은 종종 두 종류 (트랜스 와 cis) 노치 ligand 상호 작용의 검사 관련. 그러나, 동물 개발 하는 동안 많은 컨텍스트에서 이러한 상호 작용 및 그들의 피드-다시 규제의 둘 다의 참여는 vivo에서 연구1,6
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공개 사항
저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.
감사의 글
저자 인정 NIH/NIGMS에서 지원 (HJN에 R01GM084135) 및 Glycoscience (부여 #110071 HJN), 그리고 톰 V. 리 토론 및 분석 실험에 대 한 제안에 대 한 감사에 대 한 미즈타 니 재단과 Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, 로버트 플레밍, 켄 어바인과 플라스 미드를 세포 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 바이오휘태커 슈나이더 s 초파리 매체, 수정된 | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone 페니실린-스트렙토마이신 100X 솔루션 | GE 헬스케어 생명과학 | ||
| CELLSTAR 6 웰 플레이트 | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 웰 플레이트 | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR 미니 쉐이커 | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| 혈구계 | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD 트랜스펙션 시약 | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 전사 키트 | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA 정제 키트) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision 도립 현미경 | VWR | ||
| 9MP USB2.0 현미경 디지털 카메라 + 고급 소프트웨어 | AmScope | MU-900 | ToupView 소프트웨어를 사용한 이미지 획득 |
| PureLink 퀵 젤 추출 키트 | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 세포 | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | R. Fleming의 선물 (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | S. Artavanis-Tsakonas의 선물 |
| pMT-톱니 벡터 | Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | S. Artavanis-Tsakonas의 선물 |
| pAc5.1-EGFP | Hugo Bellen의 선물 | ||
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | FAM-MGB 염료 함유 |
| FAM-MGB 염료를 사용한 | CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR 시스템 | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block 모듈 |
참고문헌
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E.
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재인쇄 및 허가
