Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen
Summary
Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.
Abstract
Communicatie in het tumor bijdragen resident of aangeworven mesenchymale stamcellen (MSCs) tot maligne progressie in meerdere soorten van kanker. Onder invloed van specifieke Milieusignalen, kunnen deze volwassen stamcellen paracrine bemiddelaars leidt tot versnelde tumorgroei en uitzaaiing vrijkomen. Het definiëren van de Overspraak tussen tumor en MSCs is van primair belang voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van kanker en identificeren van nieuwe doelstellingen voor therapeutische interventie.
Kankercellen produceren grote hoeveelheden extracellulaire blaasjes (EVs), die diep van invloed kunnen zijn op het gedrag van de doelcellen in de tumor communicatie of op verre locaties. Tumor EVs omsluiten functionele biomoleculen, met inbegrip van inflammatoire RNAs en (onco) eiwitten, die stromale cellen opleiden kunnen om het metastatische gedrag van kankercellen of deel te nemen aan de vorming van vooraf metastatische niche. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een preklinische kanker muismodel waarmee specifieke evaluatie van de EV-gemedieerde Overspraak tussen tumor en de mesenchymale stamcellen. Eerst beschrijven we de zuivering en karakterisering van het EVW tumor-uitgescheiden en de beoordeling van de internalisering van de EV door MSCs. We maken dan gebruik van een multiplex kraal gebaseerde immunoassay te evalueren van de wijziging van het MSC cytokine-expressie profiel geïnduceerd door kanker EVs. Tot slot, we illustreren de generatie van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom die de tumor-MSC interactie recapituleert, en Toon van de bijdrage van MSCs EV-opgeleid tot tumor groei en metastase vorming.
Ons model biedt de mogelijkheid om te definiëren hoe kanker EVs vorm een tumor-ondersteunende omgeving, en te beoordelen of de blokkade van de EV-gemedieerde communicatie tussen tumor en MSCs voorkomt kanker progressie.
Introduction
De tumor communicatie neemt actief deel aan de meeste, zo niet alle, aspecten van tumorvorming en kanker progressie, met inbegrip van metastase vorming en de ontwikkeling van resistentie tegen therapeutics1. Dit onderstreept de noodzaak van preklinische orthotopic kanker Muismodellen waarmee dissectie van de complexe tumor-stroma-interacties in de niche van de tumor.
Onder de vele cellulaire componenten van de communicatie van de tumor bijdragen mesenchymale stamcellen (MSCs) sterk tot kanker progressie in meerdere soorten kanker zoals kanker van de borst, prostaatkanker, hersentumoren, multiple myeloom en Osteosarcoom2 ,3,4,5,6,7. MSCs zijn multipotente stamcellen, die zich in verschillende volwassen en foetale weefsels bevinden, met inbegrip van het beenmerg, adipeus weefsel, placenta, navelstrengbloed en anderen8,9. In antwoord op kanker gegenereerde inflammatoire signalen, MSCs migreren naar tumor websites integreren in de communicatie van de tumor en uiteindelijk in kanker-ondersteunende cellen10onderscheiden. Deze kanker-geassocieerde MSCs bieden essentiële factoren (dat wil zeggen, groeifactoren, chemokines cytokines en immunosuppressieve bemiddelaars) voor de tumor progressie handelt zowel op tumorcellen en op de omliggende stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. terwijl de tumor-bevordering van gevolgen van kanker-geassocieerde MSCs zijn onderzocht in talrijke modellen van de kanker, de mechanismen waardoor tumorcellen MSCs herprogrammeren om de vorm van een kanker-bevordering van niche slecht worden begrepen. Hier beschrijven we de generatie van een orthotopic xenograft model waarmee specifiek de studie van de pro-tumorigene interactie tussen bot kankercellen en MSCs via extracellulaire blaasjes (EVs).
EVW zijn cruciale bemiddelaars van de intercellulaire communicatie tussen tumor en stromale cellen14. EVW voeren functionele biomoleculen van de cel van oorsprong, met inbegrip van eiwitten, lipiden en regelgevende RNAs. Eenmaal uitgebracht in de extracellulaire ruimte, deze blaasjes kunnen worden overgenomen door de omringende cellen of naar verre locaties via het bloed of de lymfatische circulatie, en diep target cel gedrag kunnen beïnvloeden. 15 , 16 , 17 bijvoorbeeld opname van kanker EVs door stromale fibroblasten kan resulteren in myofibroblast differentiatie ondersteunen angiogenese en tumor groei in vivo18,19, internalisering door endothelial versnellen cellen kunnen tumor angiogenese stimuleren en verhogen de vasculaire permeabiliteit16,20, en interactie met immune cellen zou kunnen leiden tot onderdrukking van de antitumorale immuunrespons21.
We onlangs aangetoond, met behulp van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom, dat tumorcellen vrij hoge hoeveelheden van het EVW die MSCs prompt te verwerven van een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype. Dit effect is te wijten aan een dramatische verandering in de MSC cytokine-expressie profiel (hierna aangeduid als “MSC onderwijs”), en kan worden voorkomen door de administratie van een therapeutische Interleukine-6 receptor (IL-6R) antilichaam7. Ons werk aangetoond dat kanker EVs cruciale modulatoren van MSC gedrag, waardoor een reden voor communicatie-gerichte benaderingen Osteosarcoom progressie halt toe te roepen. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de EV-gemedieerde tumor-MSC interactie in vivo. Dit model is bedoeld om: 1) specifiek de kanker EV-geïnduceerde veranderingen van MSC gedrag definiëren in de communicatie van de tumor, 2) evalueren hoe deze interactie bijdraagt aan tumor botgroei en metastase vorming en 3) studie of verstoren de EV-gemedieerde Overspraak in vivo voorkomt dat de progressie van kanker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor-uitgescheiden extracellulaire blaasjes (EVs) kunnen wijzigen en de Fysiologie van lokale en verre mesenchymale cellen voor het genereren van een tumor-ondersteunende omgeving. Hier beschrijven we de generatie van een preklinische muismodel van osteosarcoom waarmee dissectie van de EV-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en mesenchymale stamcellen cellen (MSCs) in vivo. We laten zien dat systemische injectie van menselijke tumor EV opgeleide MSCs in muizen die Osteosarcoom xenografts sterk groei en me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.R. Baglio werd gesteund door een fellowship door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medegefinancierd door de Europese Unie. Bovendien heeft dit project ontvangen financiering van de Europese Unie Horizon 2020 programma voor onderzoek en innovatie onder de Marie Sklodowska-Curie-Subsidieovereenkomst geen 660200 (S.R. Baglio).
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -. H., Chang, M. -. C., Tsai, K. -. S., Hung, M. -. C., Chen, H. -. L., Hung, S. -. C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
