Injeção direta de câncer-derivado de vesículas extracelulares (EVs) leva a reprogramação da medula óssea, apoiando a progressão do tumor; no entanto, que as células mediam este efeito é claro. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para investigar mediada por EV células-tronco mesenquimais de tumor (MSC) interações na vivo, revelando um papel crucial para MSCs EV-educado em metástase.
Dentro o microambiente do tumor, residentes ou recrutadas tronco células mesenquimais (MSCs) contribuir para a progressão maligna em vários tipos de câncer. Sob a influência dos sinais ambientais específicos, essas células-tronco adultas pode liberar mediadores parácrina, levando ao crescimento acelerado do tumor e metástases. Definir o crosstalk entre tumor e MSCs é de primordial importância para compreender os mecanismos subjacentes a progressão do câncer e identificar novos alvos para intervenção terapêutica.
As células cancerosas produzem quantidades elevadas de vesículas extracelulares (EVs), que podem afetar profundamente o comportamento das células alvo no microambiente do tumor ou em locais distantes. Tumor EVs Coloque biomoléculas funcionais, incluindo inflamatórias RNAs e proteínas (onco), que podem educar as células do estroma para melhorar o comportamento metastático de células cancerígenas ou para participar na formação pré-metastático nicho. Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de mouse de câncer pré-clínicos que permite a avaliação específica do crosstalk EV-negociada entre o tumor e as células-tronco mesenquimais. Primeiro, descrevemos a purificação e caracterização de tumor-secretada EVs e a avaliação da internalização de EV por MSCs. Então fazemos uso de um imunoensaio baseado no grânulo multiplex para avaliar a alteração do perfil de expressão de citocinas do MSC induzida pelo câncer EVs. Finalmente, podemos ilustrar a geração de um modelo de mouse de transplante ortotópico bioluminescentes de osteossarcoma que recapitula a interação de tumor-MSC e mostrar a contribuição da EV-educado MSCs para formação de crescimento e a metástase do tumor.
Nosso modelo fornece a oportunidade de definir como câncer EVs moldam um ambiente de suporte a tumor e para avaliar se o bloqueio da comunicação mediada por EV entre tumor e MSCs impede a progressão do câncer.
O microambiente do tumor participa activamente na maioria, se não todos, os aspectos da progressão tumorigênese e câncer, incluindo a formação de metástases e o desenvolvimento de resistência à terapêutica1. Isto sublinha a necessidade de modelos de rato de câncer ortotópico pré-clínicos que permitem a dissecação das interações complexas tumor-estroma ocorrendo no nicho de tumor.
Entre os muitos componentes celulares do microambiente do tumor, as células-tronco mesenquimais (MSCs) contribuem muito para a progressão do cancro em vários tipos de câncer, como câncer de mama, câncer de próstata, tumores cerebrais, mieloma múltiplo e osteossarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs são células tronco que residem em vários tecidos fetais e adultos, incluindo a medula óssea, tecido adiposo, placenta, sangue de cordão umbilical e outros8,9. Em resposta a sinais inflamatórios gerado pelo câncer, MSCs migram para localizações tumorais, incorporam o microambiente do tumor em, finalmente, se diferenciar em células de câncer-suporte10. Estas MSCs câncer associadas fornecem fatores essenciais (ou seja, fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas e mediadores imunossupressoras) para progressão do tumor agindo em células tumorais e no estroma circundante2, 3 , 11 , 12 , 13. enquanto os efeitos de tumor-promoção do MSCs associada a câncer têm sido investigados em vários modelos de câncer, os mecanismos pelos quais células tumorais reprogram MSCs para dar forma a um nicho de câncer-promoção são mal compreendidos. Aqui descrevemos a geração de um modelo de transplante ortotópico especificamente, permite o estudo da interação entre as células de câncer de osso e MSCs pro-oncogenicidade através de vesículas extracelulares (EVs).
Sve é mediadores cruciais da comunicação intercelular entre tumor e células estromais14. SVE carrega biomoléculas funcionais da célula de origem, incluindo proteínas, lípidos e RNAs regulatórios. Uma vez lançado no espaço extracelular, essas vesículas podem ser absorvidas por células circundantes ou levadas para locais distantes através do sangue ou a circulação linfática e podem influenciar profundamente o comportamento de célula de destino. 15 , 16 , 17 por exemplo, absorção de câncer EVs por fibroblastos do estroma pode resultar na diferenciação de Miofibroblasto apoiando a angiogênese e acelerando o tumor crescimento na vivo18,19, internalização por endotelial as células podem estimular a angiogênese do tumor e aumentar a permeabilidade vascular16,20, e interação com células do sistema imune pode levar à supressão da resposta de imune antitumoral21.
Nós recentemente demonstrado, usando um modelo do rato de transplante ortotópico bioluminescentes de osteossarcoma, que células tumorais liberam quantidades elevadas de EVs que solicitam MSCs para adquirir um fenótipo oncogenicidade-pro e pro-metastático. Este efeito é devido a uma mudança dramática no perfil de expressão de citocinas MSC (referido como “Educação da MSC”) e pode ser prevenido pela administração do anticorpo terapêutico do receptor de interleucina-6 (IL-6R)7. Nosso trabalho demonstrou que o câncer EVs são moduladores cruciais do comportamento do MSC, proporcionando assim uma justificativa para abordagens microambiente-alvo deter a progressão do osteossarcoma. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para investigar o tumor mediada por EV-MSC interação na vivo. Este modelo destina-se a: 1) especificamente definir as alterações de câncer induzido por EV de comportamento MSC no microambiente do tumor, 2) avaliar como essa interação contribui para o crescimento do tumor ósseo e formação de metástases e 3) estudo se interferir com o crosstalk mediada por EV em vivo impede a progressão do câncer.
Vesículas extracelulares secretadas por tumor (EVs) podem alterar a fisiologia das células mesenquimais locais e distantes para gerar um ambiente de apoio-tumor. Aqui descrevemos a geração de um modelo de mouse pré-clínicos de osteossarcoma que permite que a dissecação das interações entre células tumorais mediada por EV e tronco mesenquimal cells (MSCs) na vivo. Nós mostramos que injeção sistêmica de tumor humano MSCs EV-educado em camundongos rolamento xenografts osteossarcoma fortemente promove…
The authors have nothing to disclose.
S.R. Baglio foi apoiado por uma bolsa pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), co-financiado pela União Europeia. Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação de Horizonte 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 660200 (a S.R. Baglio).
Equipment | |||||||
Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
-80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
Autoclave | Astell | n.a. | |||||
Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
Culture media | |||||||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
heparin | LEO | 012866-08 | |||||
Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
Cells | |||||||
adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
Disposables | |||||||
Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
Reagents / kits | |||||||
paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
BSA | Sigma | A8412 | |||||
CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
Mice experiments | |||||||
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
Sutures | Ethicon | V926H | |||||
Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |