أساليب لفترات الخوادر التدريج والقياس للجناح تصبغ المورفولوجية جوتيفيرا
Summary
ويرد وصف بروتوكولات لتنظيم فترات الخوادر وقياس الجناح تصبغ جوتيفيرا المورفولوجية . التدريج والتحديد الكمي لتصبغ توفر أساسا متينا لدراسة آليات إنمائية من صفات الكبار وتمكن المقارنة التنمية سمة.
Abstract
الأنواع المتنوعة من المورفولوجية (ذبابة الفاكهة) توفير الفرص لدراسة آليات التنمية والتغييرات الوراثية مسؤولة عن التغيرات التطورية. على وجه الخصوص، مرحلة الكبار مصدرا غنيا للصفات المورفولوجية للمقارنة، بما في ذلك الجناح تصبغ المقارنة. لدراسة الفوارق التنموية بين الأنواع، المراقبة المفصلة والتدريج المناسبة مطلوبة للمقارنة الدقيقة. هنا يصف لنا البروتوكولات الخاصة بالتدريج لفترات الخوادر والتحديد الكمي لتصبغ الأجنحة في ذبابة الفاكهة البولكا منقط، جوتيفيرا المورفولوجية. أولاً، نحن تصف طريقة الملاحظة المورفولوجية مفصلة وتعريف المراحل الخوادر استناداً إلى مورفولوجيس. ويشمل هذا الأسلوب أسلوب لإزالة بوباريوم، وهي قضية تشيتينوس الخارجي عذراء، لتمكين المراقبة المفصلة من مورفولوجيس الخوادر. ثانيا، نحن تصف طريقة لقياس مدة محددة المراحل الخوادر. وأخيراً، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للجناح تصبغ استناداً إلى تحليل الصور باستخدام الصور الرقمية والبرمجيات إيماجيج. بهذه الأساليب، علينا إرساء أساس متين لمقارنة العمليات التنموية من سمات الكبار خلال مراحل الخوادر.
Introduction
بعض من الصفات المورفولوجية المورفولوجية هي التنوع بين الأنواع1،2،3،،من45. يمكن أن نتناول المسألة التنوع المورفولوجي كيف ينشأ عن طريق مقارنة آليات توليد هذه مورفولوجيس. أمثلة من هذا القبيل مورفولوجيس trichomes اليرقات وأمشاط الجنس الكبار والجهاز التناسلي الخارجي، تصبغ البطن والجناح تصبغ6،،من78،9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15-لدراسة الاختلافات المورفولوجية بين البالغين، رصد وتحليل المراحل الخوادر مهمة، يتحدد مصير الصفات الكبار في المراحل المتأخرة اليرقات وعائدات morphogenesis اللاحقة خلال فترة الخوادر.
في دراسات علم الأحياء التنموي من melanogaster المورفولوجية، “ساعات الاتحادية” (ساعات بعد تشكيل الخوادر) هو الأسلوب المشترك للإشارة إلى مرحلة الخوادر16. هذا النظام يستخدم الوقت المطلق بعد تشكيل الخوادر ومريحة للغاية للتجارب الروتينية. ومع ذلك، سرعة النمو قد تختلف بين الخوادر، وقد تتأثر بالاختلافات الوراثية أو جينية أو ميكرونفيرونمينتال طفيفة، ولذلك بعد نفس الوقت المطلق بعد تشكيل الخوادر لا يضمن أن الخوادر في الوقت نفسه مرحلة النمو. في كثير من الحالات، مراحل المعرفة بالخصائص المورفولوجية الأفضل للمقارنة بين عدة أفراد. وبخاصة، يتطلب مقارنة بين الأنواع التدريج الدقيق والمقارنة بين المراحل (مثلى) المطابق.
اعترف Bainbridge وبوونيس17 20 مراحل الخوادر (P1 إلى P15(ii)) استناداً إلى الخصائص المورفولوجية الخوادر melanogaster المورفولوجية . هذا التدريج هو النظام الأكثر استخداماً ل انطلاق التنمية المورفولوجية18. وفي دراسة سابقة، أجرينا التدريج الخوادر من جوتيفيرا المورفولوجية لإرساء أساس للجناح تصبغ الدراسات19. دال-جوتيفيرا نمط بولكا-نقطة سوداء على اجنحتها وهو واحد من الأنواع النموذجية للجناح تصبغ تشكيل20. على الرغم من أن أشرنا إلى معايير مورفولوجية الموصوفة في Bainbridge وبونس البحوث17، قمنا بقياس المدد المرحلة مباشرة بالملاحظات المسلسل19، بدلاً من استخدام تقدير المدد المرحلة Bainbridge و بونس من لاحظ تردد. هنا يصف لنا طريقة التدريج الخوادر وقياس المدد الزمنية لمراحل الخوادر المورفولوجية المستخدمة في فوكوتومي وآخرون19.
لدراسة الآلية التنموية لتصبغ الجناح، نحن بحاجة إلى معرفة متى يحدث التصبغ في المراحل الخوادر أو الكبار. فوكوتومي وآخرون. 19 كمياً الكثافة الضوئية (ODs) من التصبغ خلال مراحل الخوادر والكبار بتحليل صورة من صور الجناح. ويعتقد أن تكون ناجمة عن تراكم الميلانين الأسود21تصبغ أجنحة المورفولوجية . للتحديد الكمي للمواد المستنفدة للأوزون، استخدمت الصور تدرج رمادي و البرمجيات (https://imagej.nih.gov/ij/) إيماجيج22 . للاعتراف وقياس التصبغ الخاصة بالموقع (ΔOD)، ونحن طرح OD خارج بقعة من OD داخل بقعة. لجعل هذا الأسلوب استنساخه وموضوعية، ينبغي أن تحدد أماكن قياس OD استخدام عروق الجناح كمعالم. في هذه المقالة، يصف لنا بالتفصيل هذا الأسلوب الكمي لتصبغ الجناح في جوتيفيرا المورفولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن تصف هنا البروتوكولات لتعريف مراحل الخوادر، إزالة بوباريوم للمراقبة المفصلة، قياس المدد الزمنية لمراحل الخوادر، وقياس كثافة البقع السوداء على جناح في جوتيفيرا د. يمكن تطبيق العديد من المورفولوجية هذه البروتوكولات والمتعلقة بالأنواع يطير، لا سيما مع تصبغ الجناح.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر شون كارول باء وتوماس ويرنر لتوفير الأرصدة يطير، ناويوكي الصمامات للمعدات، بيونغ سوك جين لمساعدته في تصوير، اغاتا كييوكازو للتوجيه وإليزابيث ناكاجيما لتحرير اللغة الإنجليزية. هذا العمل كان يدعمها كاكينهي 17 ك 19427 و “مؤسسة العلوم تأكيدا”.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
