Methoden voor Staging pop perioden en meting van de pigmentatie van de vleugel van Drosophila guttifera
Summary
Protocollen voor tijdelijke pop perioden en meting van vleugel pigmentatie van Drosophila guttifera worden beschreven. Fasering en kwantificering van pigmentatie vormen een solide basis voor de studie van ontwikkelingsstoornissen mechanismen voor volwassen traits en inschakelen van interspecifieke vergelijking van trait ontwikkeling.
Abstract
Gediversifieerde soorten Drosophila (fruitvlieg) bieden mogelijkheden om te studeren van mechanismen van ontwikkeling en genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor de evolutionaire veranderingen. In het bijzonder is het volwassen stadium een rijke bron van morfologische eigenschappen voor interspecifieke vergelijking, met inbegrip van vleugel pigmentatie vergelijking. Studeren developmental verschillen tussen de soorten, zijn gedetailleerde observatie en passende enscenering nodig voor nauwkeurige vergelijking. We beschrijven hier protocollen voor de enscenering van pop perioden en kwantificering van vleugel pigmentatie in een polka-dotted fruitvlieg, Drosophila guttifera. Eerst beschrijven we de methode voor gedetailleerde morfologische waarneming en definitie van pop fasen op basis van morphologies. Deze methode omvat een techniek voor het verwijderen van de puparium, die de buitenste chitinous voor de verpopping geldt, om gedetailleerde observatie van pop morphologies. Ten tweede, beschrijven we de methode voor het meten van de duur van de omschreven pop stappen. Ten slotte, beschrijven we de methode voor de kwantificering van de vleugel pigmentatie op basis van de analyse van de afbeelding met behulp van digitale beelden en ImageJ software. Met deze methoden kunnen we een solide basis voor het vergelijken van de ontwikkelings processen voor volwassen traits tijdens pop stadia vaststellen.
Introduction
Sommige van de morfologische eigenschappen van Drosophila zijn gediversifieerd onder soorten1,2,3,4,5. Wij kunnen benaderen de kwestie van hoe morfologische diversiteit ontstaat door het vergelijken van de mechanismen van de generatie van deze morphologies. Voorbeelden van dergelijke morphologies zijn larvale schubben, erotische sex kammen, externe genitale toestellen, abdominale pigmentatie en vleugel pigmentatie6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. studeren morfologische verschillen tussen volwassenen, waarneming en analyse van de pop stadia zijn belangrijk, omdat het lot van volwassen eigenschappen wordt bepaald in de late larvale stadia en latere morfogenese gedurende de pop opbrengsten.
In studies van de ontwikkelingsbiologie van Drosophila melanogaster, “uren APF” (uur na pop vorming) is de gemeenschappelijke methode om aan te geven een popstadium16. Dit systeem maakt gebruik van absolute tijd na pop vorming en is erg handig voor routinematige experimenten. Echter, developmental snelheid kan verschillen van poppen, en kan worden beïnvloed door lichte microenvironmental, genetische en epigenetische verschillen, en dus met dezelfde absolute tijd na pop vorming garandeert niet dat de poppen tegelijkertijd zijn ontwikkelingsstadium. In veel gevallen zijn de fasen die zijn gedefinieerd door morfologische kenmerken voorkeur voor het vergelijken van meerdere personen. Met name vereist een vergelijking tussen soorten nauwkeurige enscenering en vergelijking tussen overeenkomstige (homologe) fasen.
Bainbridge en Bownes17 erkend 20 pop stadia (P1 P15(ii)) gebaseerd op morfologische kenmerken van Drosophila melanogaster poppen. Deze enscenering is het meest gebruikte systeem van morfologische developmental tijdelijke18. In een eerdere studie uitgevoerd we pop opvoering van Drosophila guttifera om vast te stellen van een basis voor studies19van de pigmentatie van de vleugel. D. guttifera heeft een zwarte polka-dot-patroon op haar vleugels en behoort tot de soort model voor vleugel pigment vorming20. Hoewel we verwezen naar de morfologische criteria beschreven de Bainbridge en Bownes onderzoek17, we rechtstreeks gemeten fase duur door seriële observaties19, in plaats van met behulp van Bainbridge en Bownes raming van de duur van de fase van waargenomen frequentie. Hier beschrijven we de methode van pop enscenering en meting van de totale duur van pop stadia van Drosophila gebruikt in Fukutomi et al.19.
Om te studeren het ontwikkelings mechanisme van vleugel pigmentatie, die we willen weten wanneer in pop of volwassen stadia de pigmentatie optreedt. Fukutomi et al. 19 gekwantificeerd optische dichtheid (ODs) van pigmentatie tijdens pop en volwassen stadia door beeldanalyse van beelden van de vleugel. De pigmentatie van Drosophila vleugels wordt gedacht te worden veroorzaakt door de opeenhoping van zwarte melanine21. Voor de kwantificering van ODs, werden grijs-schaal afbeeldingen en ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 gebruikt. We aftrekken om te erkennen en kwantificeren van de plek-specifieke pigment (ΔOD), de OD buiten een plek van de OD binnenkant van een plek. Om deze methode reproduceerbaar en objectieve, moeten de plaatsen van OD meting worden bepaald met behulp van vleugel aderen als monumenten. In dit artikel beschrijven we in detail deze methode voor de kwantificering van de vleugel pigmentatie in Drosophila guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier de protocollen voor definitie pop fasen, verwijderen van de puparium voor gedetailleerde observatie, meting van de duur van pop stadia, en meting van de intensiteit van de zwarte vlekken op een vleugel in D. guttifera. Deze protocollen kunnen worden toegepast voor vele Drosophila en gerelateerde vliegen soorten, vooral soorten met vleugel pigmentatie.
Diepgaande waarneming en beschrijving van meer gedetailleerde developmental gebeurtenissen zouden verdere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Sean B. Carroll en Thomas Werner voor het verstrekken van vliegen voorraden, Naoyuki Fuse voor apparatuur, Byung-Seok Jin voor zijn hulp bij het filmen, Kiyokazu Agata voor begeleiding en Elizabeth Nakajima voor het bewerken van de Engelse. Dit werk werd gesteund door KAKENHI 17K 19427 en Takeda Science Foundation.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
