ुपाल समय और Drosophila guttifera के पंख रंजकता की माप मचान के लिए तरीके
Summary
ुपाल समय और Drosophila guttifera की विंग रंजकता की माप मचान के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं । स्टैगिंग और रंजकता के ठहराव वयस्क लक्षण के विकासात्मक तंत्र का अध्ययन करने और विशेषता के विकास के एक विशिष्ट तुलना सक्षम करने के लिए एक ठोस आधार प्रदान करते हैं ।
Abstract
Drosophila की विविध प्रजातियों (फल मक्खी) विकास के तंत्र और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए जिंमेदार बदलाव के अध्ययन के लिए अवसर प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, वयस्क मंच एक विशिष्ट तुलना के लिए रूपात्मक लक्षण का एक समृद्ध स्रोत है, पंख रंजकता तुलना सहित । प्रजातियों के बीच विकासात्मक मतभेदों का अध्ययन करने के लिए, विस्तृत अवलोकन और उचित मचान सटीक तुलना के लिए आवश्यक हैं । यहाँ हम ुपाल समय और एक पोल्का-बिंदीदार फल मक्खी में विंग रंजकता के ठहराव के मचान के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, Drosophila guttifera. सबसे पहले, हम विस्तृत रूपात्मक अवलोकन और morphologies के आधार पर ुपाल चरणों की परिभाषा के लिए विधि का वर्णन । इस विधि में puparium को हटाने के लिए एक तकनीक शामिल है, जो pupa का बाहरी chitinous मामला है, ुपाल morphologies का विस्तृत अवलोकन करने में सक्षम है । दूसरा, हम परिभाषित ुपाल चरणों की अवधि को मापने के लिए विधि का वर्णन । अंत में, हम डिजिटल छवियों और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण के आधार पर विंग रंजकता के ठहराव के लिए विधि का वर्णन । इन तरीकों के साथ, हम ुपाल चरणों के दौरान वयस्क लक्षण के विकास की प्रक्रिया की तुलना के लिए एक ठोस आधार स्थापित कर सकते हैं ।
Introduction
Drosophila के रूपात्मक लक्षण के कुछ प्रजातियों के बीच विविध रहे है1,2,3,4,5। हम कैसे रूपात्मक विविधता इन morphologies की पीढ़ी के तंत्र की तुलना से उठता है के सवाल का दृष्टिकोण कर सकते हैं । इस तरह के morphologies के उदाहरण हैं लार्वा trichomes, वयस्क सेक्स कंघी, बाहरी जननांग तंत्र, उदर रंजकता, और पंख रंजकता6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. वयस्कों के बीच रूपात्मक मतभेदों का अध्ययन करने के लिए, अवलोकन और ुपाल चरणों का विश्लेषण महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वयस्क लक्षण के भाग्य देर लार्वा चरणों में निर्धारित किया जाता है और ुपाल अवधि के दौरान बाद morphogenesis आय.
विकासात्मक जीवविज्ञान अध्ययन में Drosophila melanogaster, “घंटे APF” (ुपाल गठन के बाद घंटे) आम तरीका है एक ुपाल मंच16से संकेत मिलता है । यह प्रणाली ुपाल गठन के बाद निरपेक्ष समय कार्यरत है और दिनचर्या के प्रयोगों के लिए बहुत सुविधाजनक है । हालांकि, विकास की गति कोषस्थों के बीच अलग हो सकता है, और मामूली आनुवंशिक, epigenetic या microenvironmental मतभेदों से प्रभावित हो सकता है, और इसलिए ुपाल गठन के बाद एक ही निरपेक्ष समय होने की गारंटी नहीं है कि कोषस्थों एक ही हैं विकासात्मक अवस्था । कई मामलों में, रूपात्मक सुविधाओं द्वारा परिभाषित चरणों कई व्यक्तियों की तुलना के लिए बेहतर कर रहे हैं । विशेष रूप से, प्रजातियों के बीच एक तुलना सटीक मचान और इसी (मुताबिक़) चरणों के बीच तुलना की आवश्यकता है ।
Bainbridge और Bownes17 मान्यता प्राप्त 20 ुपाल चरणों (P1 to P15 (ii)) के आधार पर रूपात्मक Drosophila melanogaster की कोषस्थों सुविधाओं पर आधारित है । इस मचान रूपात्मक विकास मचान के सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली है18। पिछले एक अध्ययन में, हम विंग रंजकता अध्ययन19के लिए एक आधार स्थापित करने के लिए Drosophila guttifera के ुपाल मचान प्रदर्शन किया । D. guttifera अपने पंखों पर एक काले पोल्का डॉट पैटर्न है और विंग रंजकता गठन20के लिए मॉडल प्रजातियों में से एक है । हालांकि हम रूपात्मक Bainbridge और ‘ Bownes अनुसंधान17में वर्णित मानदंडों को भेजा, हम सीधे धारावाहिक प्रेक्षणों19, के बजाय Bainbridge और मंच अवधि के Bownes ‘ आकलन का उपयोग कर के स्तर की अवधि मापा से मनाया आवृत्ति । यहां हम ुपाल मचान और Fukutomi एट अल19में प्रयुक्त Drosophila के ुपाल चरणों की अवधि के माप की विधि का वर्णन ।
विंग रंजकता के विकास तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हमें पता है जब ुपाल या वयस्क चरणों में रंजकता होता है की जरूरत है । Fukutomi एट अल. विंग छवियों की छवि विश्लेषण द्वारा ुपाल और वयस्क चरणों के दौरान रंजकता की 19 मात्रा ऑप्टिकल घनत्व (ODs) । Drosophila पंखों की रंजकता काले मेलेनिन21के संचय के कारण होने लगा है । ODs, ग्रे-स्केल इमेजेस और ImageJ सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) के ठहराव के लिए22 का इस्तेमाल किया गया । पहचान और स्पॉट विशिष्ट रंजकता (ΔOD) यों तो, हम एक स्थान के अंदर आयुध डिपो से एक स्थान के बाहर आयुध डिपो घटाना । इस विधि को प्रतिलिपि और उद्देश्य बनाने के लिए, आयुध डिपो की माप के स्थान को पंख की नसों के रूप में उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए । इस आलेख में, हम विस्तार में Drosophila guttiferaमें विंग रंजकता के ठहराव की इस विधि का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां ुपाल चरणों की परिभाषा के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, विस्तृत अवलोकन के लिए puparium को हटाने, ुपाल चरणों की अवधि को मापने, और D. guttiferaमें एक शाखा पर काले धब्बे की तीव्रता का माप । इन प्रोटोकॉल कई Drosophila और ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम शॉन बी कैरोल और थॉमस वर्नर धंयवाद फ्लाई स्टॉक प्रदान करने के लिए, उपकरण के लिए Naoyuki फ्यूज, Byung Seok जिन फिल्माने में उनकी सहायता के लिए, Kiyokazu Agata सलाह के लिए और एलिजाबेथ Nakajima अंग्रेजी संपादन के लिए । इस काम को KAKENHI 17K19427 और टाकेडा साइंस फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
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