Metoder for Staging Pupal perioder og måling av vingen pigmentering i Drosophila guttifera
Summary
Protokoller for staging pupal perioder og måling av vingen pigmentering i Drosophila guttifera er beskrevet. Regi og kvantifisering av pigmentering danner et solid grunnlag for å studere utviklingsmessige mekanismer av voksen trekk og aktiverer interspesifikk sammenligning av trekk utvikling.
Abstract
Diversifisert arter av Drosophila (frukt fly) gir muligheter for å studere mekanismer for utvikling og genetiske endringer ansvarlig for utviklingsendringene. Spesielt er det voksne stadiet en rik kilde til morfologiske egenskaper for interspesifikk sammenligning, inkludert fløyen pigmentering sammenligning. For å studere utviklingsmessige forskjeller arter, er detaljert observasjon og riktig oppsetning nødvendig for nøyaktig sammenligning. Her beskriver vi protokoller for oppsamling av pupal perioder og kvantifisering av vingen pigmentering i en polka-prikkete frukt fly, Drosophila guttifera. Først beskriver vi metoden for detaljert morfologiske observasjon og definisjon av pupal stadier basert på morphologies. Denne metoden inneholder en teknikk for å fjerne de blodsugende, som er den ytre chitinous saken av puppe, aktivere detaljert observasjon av pupal morphologies. Andre beskriver vi metoden for å måle varigheten av definerte pupal stadier. Til slutt, vi beskriver metoden for kvantifisering av vingen pigmentering basert på bildeanalyser med digitale bilder og ImageJ programvare. Disse metodene, kan vi opprette et solid grunnlag for sammenligning utviklingsprosesser av voksen trekk under pupal stadier.
Introduction
Noen av de morfologiske egenskapene av Drosophila er diversifisert blant arter,1,,2,,3,,4,,5. Vi kan nærme spørsmålet hvordan morfologiske mangfold oppstår ved å sammenligne mekanismer for generering av disse morphologies. Eksempler på slike morphologies er larver trichomes, voksen sex kammer, ytre genital apparat, abdominal pigmentering og vinge pigmentering6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. for å studere morfologiske forskjeller blant voksne, observasjon og analyse av pupal stadier er viktig, fordi skjebnen til voksen trekk bestemmes på slutten larver stadier og påfølgende morphogenesis fortsetter i pupal perioden.
I utviklingsbiologi studier av Drosophila melanogaster, “timer APF” (timer etter pupal formasjon) er den vanligste metoden å angi en pupal scenen16. Dette systemet har absolutt tid etter pupal formasjon og er veldig praktisk for rutinemessig eksperimenter. Imidlertid utviklingsmessige hastigheten kan variere mellom pupae, og kan påvirkes av små genetisk, epigenetic eller microenvironmental forskjeller, og derfor har samme absolutte tidspunkt etter pupal formasjon garanterer ikke at pupae er på samme utviklingsstadiet. I mange tilfeller er stadier definert av morfologiske funksjoner å foretrekke for sammenligning av flere personer. Spesielt krever en sammenligning mellom artene presis regi og sammenligning mellom tilsvarende (homologe) stadier.
Bainbridge og Bownes17 anerkjent 20 pupal stadier (P1 til P15(ii)) basert på morfologiske funksjoner i Drosophila melanogaster pupae. Denne oppsetningen er det mest brukte systemet morfologiske utviklingsmessige oppsetning18. I en tidligere studie utført vi pupal oppsetning av Drosophila guttifera å etablere et grunnlag for vinge pigmentering studier19. D. guttifera har en sort polka-dot mønster på sine vinger og er en av modell arter for vinge pigmentering formasjon20. Selv om vi omtalt morfologiske vilkårene beskrevet i Bainbridge og Bownes’ forskning17, målte vi direkte scenen varighet av føljetong observasjoner19, istedet for benytter Bainbridge og Bownes’ estimering av scenen varigheter fra observert frekvens. Her beskriver vi metoden pupal regi og måling av varighet for pupal stadier av Drosophila brukes i Fukutomi et al19.
For å studere utviklingsmessige mekanisme fløyen pigmentering, trenger vi å vite når pupal eller voksen stadier pigmentering oppstår. Fukutomi et al. 19 kvantifisert optisk tettheter (ODs) av pigmentering under pupal og voksen stadier av bildeanalyse fløyen bilder. Pigmentering i Drosophila vinger antas å skyldes opphopning av svart melanin21. For kvantifisering av ODs, ble gråtonebilder og ImageJ programvare (https://imagej.nih.gov/ij/)22 brukt. Å gjenkjenne og kvantifisere spot-spesifikke pigmentering (ΔOD), trekker vi OD utenfor et sted fra OD i et sted. For å gjøre denne metoden reproduserbare og objektiv, bør steder av OD måling fastsettes ved hjelp av vingen årer som landemerker. I denne artikkelen beskrive vi i detalj denne metoden for kvantifisering av vingen pigmentering i Drosophila guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her protokollene for definisjonen av pupal stadier, fjerne blodsugende for detaljert observasjon, måling varighet for pupal stadier, og måling av intensiteten av svarte flekker på en fløy i D. guttifera. Disse protokollene kan brukes for mange Drosophila og relaterte fly arter, særlig arter med vinge pigmentering.
Grundig observasjon og beskrivelse av mer detaljert utviklingsmessige hendelser vil gjøre videre underinndeling av stadier. I mange tilfeller en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Sean B. Carroll og Thomas Werner for å fly aksjer, Naoyuki sikring for utstyr, Byung Seok Jin for hans hjelp filming, Kiyokazu Agata for veiledning og Elizabeth Nakajima for engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI 17K 19427 og Takeda Science Foundation.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
