Metoder för mellanlagring Pupp perioder och mätning av Wing pigmentering i Drosophila guttifera
Summary
Protokoll för mellanstationer Pupp perioder och mätning av wing pigmentering i Drosophila guttifera beskrivs. Mellanlagring och kvantifiering av pigmentering ger en solid grund för att studera utvecklingsmässiga mekanismer av vuxna drag och aktivera mellanartskonkurrens jämförelse av drag utveckling.
Abstract
Diversifierad arter av Drosophila (bananflugan) ger möjligheter att studera mekanismer för utveckling och genetiska förändringar ansvarig för evolutionära förändringar. I synnerhet är vuxen scenen en rik källa av morfologiska drag för mellanartskonkurrens jämförelse, inklusive wing pigmentering jämförelse. För att studera utvecklingsmässiga skillnaderna bland arter, krävs detaljerad observation och lämpliga iscensättning för exakt jämförelse. Här beskriver vi protokoll för iscensättning av Pupp perioder och kvantifiering av wing pigmentering i en polka-prickade bananflugan, Drosophila guttifera. Först beskriver vi metoden för detaljerad morfologiska observation och definition av Pupp stadier baserat på morfologier. Metoden innehåller en teknik för att ta bort den puparium, vilket är yttre kitina fallet av puppan, aktivera detaljerad observation av Pupp morfologier. Det andra beskriver vi metoden för att mäta längden på definierade Pupp etapper. Slutligen beskriver vi metoden för kvantifiering av wing pigmentering baserat på bildanalys med hjälp av digitala bilder och ImageJ programvara. Med dessa metoder, kan vi upprätta en solid grund för att jämföra utvecklingsprocesser av vuxna drag under Pupp stadier.
Introduction
Vissa morfologiska drag av Drosophila är diversifierade bland arter1,2,3,4,5. Man kan närma sig frågan hur morfologiska mångfald uppstår genom att jämföra mekanismerna av generation av dessa morfologier. Exempel på sådana morfologier är larval trichomes, vuxna kön kammar, externa genitala apparater, buken pigmentering och påskyndar pigmentering6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. för att studera morfologiska skillnader bland vuxna, observation och analys av Pupp arrangerar är viktiga, eftersom ödet för vuxna drag bestäms i sena larval stadier och efterföljande morfogenes fortsätter under perioden Pupp.
I utvecklingsbiologi studier av Drosophila melanogaster, ”timmar APF” (timmar efter Pupp bildandet) är den vanliga metoden att ange en Pupp etapp16. Detta system använder absolut tid efter Pupp bildandet och är mycket bekvämt för rutinmässig experiment. Dock utvecklingsmässiga hastighet kan variera bland puppor, och kan påverkas av genetiska och epigenetiska microenvironmental skillnader, och därför har samma absolut tid efter Pupp bildandet garanterar inte att puppor är på samma utvecklingsstadier. I många fall är arrangerar definieras av morfologiska egenskaper att föredra för att jämföra flera individer. Särskilt kräver en jämförelse mellan arter exakt iscensättning och jämförelse mellan motsvarande (homolog) stadier.
Bainbridge och Bownes17 erkänt 20 Pupp etapper (P1 till P15(ii)) baserat på morfologiska egenskaper av Drosophila melanogaster puppor. Denna iscensättning är det mest använda systemet morfologiska utvecklingsmässiga mellanlagringsplatsen18. I en tidigare studie har utfört vi Pupp iscensättning av Drosophila guttifera för att skapa en grund för wing pigmentering studier19. D. guttifera har ett svart polka-dot mönster på vingarna och är en modell art för wing pigmentering bildandet20. Även om vi hänvisat till de morfologiska kriterier som beskrivs i den Bainbridge och Bownes’ forskning17, vi mätt direkt scenen varaktigheter med seriell observationer19, istället för att använda Bainbridge och Bownes’ uppskattning av scenen varaktigheter från observerade frekvens. Här beskriver vi metoden för Pupp iscensättning och mätning av varaktigheter Pupp stadier av Drosophila används i Fukutomi et al19.
För att studera utvecklingsmässiga mekanismen av wing pigmentering, behöver vi veta när i Pupp eller vuxen steg pigmentering uppstår. Fukutomi et al. 19 kvantifieras optiska densitet (ODs) pigmentering under Pupp och vuxna stadier av bildanalys av wing bilder. Pigmenteringen Drosophila vingar tros orsakas av ansamling av svart melanin21. För kvantifiering av ODs användes gråskala bilder och ImageJ programvara (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . För att identifiera och kvantifiera plats-specifika pigmentering (ΔOD), subtraherar vi OD utanför en plats från OD inuti en plats. För att göra denna metod reproducerbara och objektiva, bör förlägger av OD mätning bestämmas med wing vener som sevärdheter. I den här artikeln beskriver vi i detalj denna metod för kvantifiering av wing pigmentering i Drosophila guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver här protokollen för definition av Pupp stadier, ta bort puparium för detaljerad observation, mätning varaktigheterna Pupp stadier och mätning av intensiteten av svarta fläckar på en flygel i D. guttifera. Dessa protokoll kan tillämpas för många Drosophila och relaterade flyga arter, särskilt med wing pigmentering.
Djupgående observation och beskrivning av mer detaljerade utvecklande händelser skulle möjliggöra ytterligare underindelning av skeden. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Sean B. Carroll och Thomas Werner för att tillhandahålla flyga bestånd, Naoyuki säkring för utrustning, Byung Seok Jin för hans hjälp med filmning, Kiyokazu Agata för mentorskap och Elizabeth Nakajima för engelska redigering. Detta arbete stöds av KAKENHI 17K 19427 och Takeda Science Foundation.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
