Evreleme pupa dönemi ve ölçüm kanat pigmentasyon Drosophila guttifera yöntemleri
Summary
Pupa dönemi ve kanat pigmentasyon Drosophila guttifera ölçümü evreleme için protokol açıklanmıştır. Evreleme ve pigmentasyon miktar yetişkin özellikleri ile gelişimsel mekanizmaları eğitim için sağlam bir temel sağlamak ve özellik geliştirme interspecific karşılaştırma etkinleştirin.
Abstract
Drosophila (meyve sineği) çeşitli türlerin gelişim ve genetik değişiklikler için evrimsel değişiklikler sorumlu mekanizmaları incelemek için fırsatlar sağlar. Özellikle, Yetişkin sahne Morfolojik özellikleri kanat pigmentasyon karşılaştırma da dahil olmak üzere interspecific karşılaştırma için zengin bir kaynağıdır. Türler arasında gelişimsel farklılıkları eğitim için detaylı gözlem ve uygun evreleme kesin karşılaştırma için gereklidir. Burada evreleme pupa dönemi ve bir polka noktalı meyve sineği Drosophila guttiferakanat pigmentasyon miktar için iletişim kuralları açıklar. İlk olarak, ayrıntılı morfolojik gözlem ve pupa aşamaları türleri üzerinde Morfoloji temel tanımını için yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem pupa türleri Morfoloji detaylı gözlem etkinleştirmek için pupa, dış chitinous durumda puparium kaldırmak için bir yöntem içerir. İkinci olarak, tanımlanmış pupa aşamaları süresi ölçme yöntemi açıklanmaktadır. Son olarak, dijital görüntü ve ImageJ yazılım kullanarak görüntü analizi dayalı kanat pigmentasyon miktar için yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler ile yetişkin özellikleri ile gelişimsel süreçleri pupa evrelerinde karşılaştırmak için sağlam bir temel oluşturabilir.
Introduction
Drosophila morfolojik özelliklerin bazıları tür1,2,3,4,5arasında çeşitlendirilmiş. Soru yaklaşım olabilir bu türleri Morfoloji nesil mekanizmaları karşılaştırarak nasıl morfolojik çeşitlilik ortaya çıkar. Böyle türleri Morfoloji larva trichomes, yetişkin sex taraklar, dış genital aparatı, karın pigmentasyon ve kanat pigmentasyon6,7,8,9, örnekler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. yetişkinler arasında morfolojik farklılıklar çalışmaya, gözlem ve analiz pupa etap yetişkin özellikleri kaderi geç larva aşamalı olarak belirlenir ve sonraki morfogenez pupa döneminde gelirleri için önemlidir.
Drosophila melanogaster, gelişim biyolojisi çalışmalarında “saat APF” (pupa kuruluşundan sonra saat) bir pupa sahne16belirtmek için yaygın bir yöntemdir. Bu sistem ve pupa kuruluşundan sonra mutlak zaman istihdam rutin deneyler için çok uygundur. Ancak, gelişimsel hız pupa arasında farklı olabilir ve küçük genetik, epigenetik veya microenvironmental farkları tarafından etkilenebilir ve bu nedenle aynı sahip mutlak zaman pupa kuruluşundan sonra pupa aynı anda olduğunu garanti etmez gelişimsel sahne. Birçok durumda, Morfolojik özellikleri tarafından tanımlanan aşamaları birden çok kişiye karşılaştırmak için tercih edilir. Özellikle, türler arasında bir karşılaştırma kesin evreleme ve karşılık gelen (homolog) aşamaları arasında karşılaştırma gerektirir.
Bainbridge ve Bownes17 tanınan 20 pupa etap (P1 P15(ii)) için Drosophila melanogaster pupa morfolojik özelliklerini temel alarak. Bu evreleme morfolojik gelişim hazırlama18en çok kullanılan sistemdir. Bir önceki çalışmada, Pupa Drosophila guttifera kanat pigmentasyon çalışmalar19için bir temel oluşturmak üzere evreleme yapılır. D. guttifera kanat üzerinde siyah puanlı desene sahip ve kanat pigmentasyon oluşumu20modeli türlerinden biridir. Her ne kadar biz açıklanan morfolojik ölçütlere anılacaktır Bainbridge ve Bownes’17araştırma, doğrudan seri gözlemler19sahne süreleri Bainbridge ve Bownes tahmini kullanmak yerine tarafından sahne süreleri ölçülen gözlenen frekansı. Burada pupa hazırlama yöntemi ve Fukutomi ve ark19‘ kullanılan Drosophila pupa aşaması süreleri ölçümü açıklayın.
Kanat pigmentasyon gelişimsel mekanizması çalışmaya, Pupa veya yetişkin aşamasında pigmentasyon ortaya çıktığında bilmemiz gereken. Fukutomi ve ark. 19 kanat görüntüleri görüntü analizi tarafından pigmentasyon pupa ve yetişkin aşamaları sırasında optik yoğunlukları (ODs) sayılabilir. Drosophila kanatları pigmentasyon siyah melanin21birikimi tarafından neden olduğu düşünülmektedir. ODs miktar için gri tonlama görüntüler ve ImageJ yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/)22 kullanılmıştır. Tanımak ve nokta özel pigmentasyon (ΔOD) ölçmek için biz bir noktadan OD içinde bir nokta dışında OD çıkarın. Tekrarlanabilir ve objektif bu yöntemi kullanabilmek için aşırı doz ölçüm yerlerin kanat damarlar yerler kullanarak tespit edilmelidir. Bu makalede, biz bu yöntemi miktar Drosophila guttiferakanat pigmentasyon, ayrıntılı olarak tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada pupa aşamaları, tanımını protokollerde pupa aşamaları sürelerini ve siyah noktalar üzerinde D. guttiferakanadında yoğunluğu ölçümü ölçme detaylı gözlem için puparium kaldırma açıklar. Bu protokoller için birçok Drosophila uygulanabilir ve sinek türleri, özellikle türler kanat pigmentasyon ile ilgili.
Daha da derinlemesine gözlem ve gelişimsel olaylarını daha ayrıntılı açıklamasını alt aşamaları sağlayacak. Birçok durumda, dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Sean B. Carroll ve Thomas Werner sinek hisse senetleri, Naoyuki sigorta donanımları için Byung Seok Jin filme, Kiyokazu rehberlik için Agata ve Elizabeth İngilizce düzenleme Nakajima’onun yardım sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser KAKENHI tarafından desteklenen 17K 19427 ve Takeda Bilim Vakfı.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
