इस पांडुलिपि ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों और एन्जियोटेन्सिन द्वितीय में फ्लोरोसेंट रंजक के विभिंन प्रशासन मार्गों के उपयोग का वर्णन-रक्त वाहिकाओं के intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण और उनके मूल्यांकन के लिए उच्च रक्तचाप प्रेरित रोल करने के लिए और endothelium का पालन करने की क्षमता ।
Epifluorescence intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी (IVM) रक्त वाहिकाओं की प्रतिरक्षा कोशिकाओं और भूमिका करने के लिए उनकी क्षमता और endothelial परत का पालन करने के लिए सक्रियण का मूल्यांकन करने के लिए एक स्थापित विधि है । फ्लोरोसेंट रंजक या fluorophore-युग्मित एंटीबॉडी के इंजेक्शन द्वारा परिचालित कोशिकाओं के दृश्य सामांयतः प्रयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों इस्तेमाल किया जा सकता है । ल्यूकोसाइट्स की बातचीत, विशेष रूप से lysozyme M+ (LysM+) monocytes में, पोत दीवार के साथ संवहनी रोग और धमनी का उच्च रक्तचाप को बढ़ावा देने में निर्णायक भूमिका निभाते हैं । हम यहाँ एन्जियोटेन्सिन द्वितीय (AngII) में मन्या धमनियों में ल्युकोसैट रोलिंग और आसंजन कल्पना और यों तो तकनीक उपस्थित IVM द्वारा चूहों में उच्च रक्तचाप प्रेरित.
एक कैथेटर नुकसान संवहनी दीवार के आरोपण और बदल रक्त कोशिका प्रतिक्रियाओं की ओर जाता है । हम अलग इंजेक्शन तकनीक और प्रशासन मार्गों की तुलना में एक LysMCre+IRG+ माउस में ल्यूकोसाइट्स कल्पना लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन की व्यापक अभिव्यक्ति के साथ और LysM में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सशर्त अभिव्यक्ति + कक्ष । LysM+ सेल सक्रियण का अध्ययन करने के लिए, हम चूहों जिसमें रोलिंग और endothelium के लिए ल्यूकोसाइट्स के आसंजन बढ़ जाता है AngII संचार का इस्तेमाल किया । हम या तो इंजेक्शन acridine नारंगी एक jugular कैथेटर का उपयोग या सीधे हालांकि पूंछ नस और रोलिंग और कोशिकाओं का पालन की राशि की तुलना में । हमने पाया है कि jugular कैथेटर प्रत्यारोपण प्रति se रोलिंग और पालन की संख्या में वृद्धि हुई LysM+ कोशिकाओं में शम-संचार LysMCre+IRG+ चूहों नियंत्रण की तुलना में. इस सक्रियण AngII-संचार चूहों में संवर्धित किया गया था । दिलचस्प है, पूंछ नस के माध्यम से सीधे इंजेक्शन acridine नारंगी LysM+ सेल आसंजन या शम-संचार चूहों में रोलिंग नहीं बढ़ा था । हम इस तरह ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों के महत्व का प्रदर्शन के साथ प्रयोग करने के दौरान vivo प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप नहीं करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट खोजकर्ताओं की पूंछ नस इंजेक्शन jugular कैथेटर इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प हो सकता है ।
धमनी का उच्च रक्तचाप हृदय रोग और मृत्यु का खतरा बढ़ जाता है और atherosclerosis, कोरोनरी हृदय रोग, और धमनी या शिरापरक thromboembolisms1के विकास को बढ़ावा देता है । उच्च रक्तचाप के विकास पर्यावरण, आनुवंशिक, अंत-स्रावी, और hemodynamic कारकों की बातचीत पर निर्भर करता है । वर्तमान में, प्रतिरक्षा और संबंधित सूजन उच्च रक्तचाप के एटियलजि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सराहना कर रहे हैं2.
प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा, टी लिम्फोसाइटों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से monocytes और मैक्रोफेज के लिए कारण AngII-प्रेरित संवहनी सूजन और उच्च रक्तचाप में शामिल होने के लिए, अपने को प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को ट्रिगर करने की क्षमता से संबंधित भाग में पाया गया3। Macrophage कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर की कमी चूहों रक्तचाप वृद्धि और संवहनी सूजन के बारे में AngII के लिए कम प्रतिक्रिया दिखाई4. पिछले एक काम में, हम दिखा सकता है कि LysM + monocytes ड्राइव नाड़ी रोग और AngII-प्रेरित उच्च रक्तचाप में सूजन5. हाल ही में, हम एक उपंयास मार्ग जिसमें जमावट कारक ग्यारहवीं प्लेटलेट्स के साथ सहयोग और पोत दीवार thrombin-निर्भर संवहनी सूजन6प्रेरित बताया । उच्च रक्तचाप में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका के बारे में वर्तमान ज्ञान Rodriguez-Iturbe एट अलद्वारा हाल ही में संक्षेप और समीक्षा की गई थी । 7
उच्च रक्तचाप के विकास में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भागीदारी के बाद से स्पष्ट हो गया, मॉडल और तकनीक पोत और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हो गया । रक्त वाहिकाओं के Epifluorescence IVM संचार रक्त कोशिकाओं और endothelium8,9,10के बीच vivo बातचीत में निरीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । इस तकनीक के साथ, (जैसे acridine नारंगी) डीएनए के साथ intercalating रंगों के इंजेक्शन nucleated कोशिकाओं कल्पना कर सकते हैं (परिसंचारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से endothelium से). rhodamin-6G या dichlorofluorescein (डीसीएफ) के साथ पृथक प्लेटलेट्स दाग पूर्व vivo धमनी या शिरापरक चोट मॉडल में प्लेटलेट युक्त थक्का कल्पना करने के लिए इंजेक्शन किया जा सकता है ।
आमतौर पर, एक jugular नस कैथेटर tracers या चिह्नित प्लेटलेट्स इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । endothelium और जमावट झरना के बाद सक्रियण के परिवर्तन दोनों monocyte सक्रियण पर प्रभाव है करने के लिए जाना जाता है । Endothelial चोट तुरंत subendothelial मैट्रिक्स अणुओं के माध्यम से प्लेटलेट सक्रियण की ओर जाता है ऊतक सील, आगामी monocyte आकर्षण और सक्रियकरण के साथ11। इसके विपरीत, एक बरकरार endothelium के लिए थक्कारोधी गुण (जैसे, ऊतक कारक मार्ग अवरोध करनेवाला या thrombomodulin के माध्यम से जाना जाता है)12 और monocyte पर प्रत्यक्ष निरोधात्मक प्रभाव, जैसे, के स्राव के माध्यम से extracellular बुलबुले युक्त microRNAs13. Monocytes एक ऊतक कारक का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है, जमावट झरना और व्यक्त की बाह्य उत्प्रेरक-सक्रिय रिसेप्टर्स (पार्स) कि thrombin द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और monocyte सक्रियण में भाग लेने14,15 . इसलिए, प्लेटलेट्स या जमावट झरना के किसी भी सक्रियण संवहनी चोट के कारण monocyte सक्रियण पर अप्रत्याशित प्रभाव पड़ सकता है और मनाया घटना के साथ हस्तक्षेप. IRG ट्रांसजेनिक LysM Cre ट्रांसजेनिक चूहों की मदद के साथ, एक डबल फ्लोरोसेंट Cre रिपोर्टर माउस (LysMCre+IRG+), हम विस्तार से एक कैथेटर और LysM पर वैकल्पिक तरीकों के साथ इंजेक्शन के प्रभाव का अध्ययन करने का प्रस्ताव+ धमनी हाइपरटेंशन के एक माउस मॉडल में myelomonocytic कोशिकाओं को16.
LysM+ monocytes को पहले हाइपरटेंशन5के विकास में फंसाने के लिए दिखाया गया । यहां हम बताते है कि LysM+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं रोल और AngII अर्क के जवाब में endothelial परत का पालन करें । इस खोज का उपयोग कर प्राप्त किया गया था LysMCre+IRG+ चूहों हमारे पिछले अध्ययन से vivo में उच्च रक्तचाप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका खोज acridine ऑरेंज6के इंजेक्शन के साथ ल्यूकोसाइट्स visualizing द्वारा,10. इस प्रकार, endothelium का पालन करने वाले कोशिका प्रकारों का भेदभाव संभव नहीं था ।
IVM संवहनी अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है और vasculature में सीधे कोशिकाओं की vivo टिप्पणियों में , लेकिन उच्च रक्तचाप के भड़काऊ संदर्भ में एक शल्य चिकित्सा डाला कैथेटर की मदद से रंजक इंजेक्शन के प्रभाव अज्ञात रहता है. कैथेटर और acridine ऑरेंज इंजेक्शन के संभावित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए हम LysMCre+IRG+ चूहों का लाभ लिया. AngII इन्फ्यूश़न रोलिंग LysM+ कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई endothelium । jugular नस में एक कैथेटर की प्रविष्टि प्रभाव और अधिक रोलिंग और पालन प्रवर्धित ल्यूकोसाइट्स AngII-भ्रमित चूहों कैथेटर प्रत्यारोपण के बिना चूहों की तुलना में एक कैथेटर के साथ साधन में पता लगाया गया । यह इंगित करता है कि एक मन्या कैथेटर के आरोपण का कारण बनता है कि उच्च रक्तचाप में देखा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ ओवरले कि घाव भरने के संदर्भ में एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया होती है18. इसके अलावा, मन्या धमनी के लिए jugular नस की निकटता के कारण एक अतिरिक्त प्रतिरक्षा सक्रियण jugular नस को प्रभावित करने से उत्पन्न हुई हो सकता है । इस प्रभाव के बाद से मौजूद नहीं था जब इंजेक्शन सीधे पूंछ नस में किए गए थे, हम मान सकते हैं कि प्रभाव डाई करने के लिए नहीं बल्कि कैथेटर डालने की प्रक्रिया के कारण किया गया था । हम यहां ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों के महत्व के प्रयोग के दौरान vivo प्रक्रियाओं में के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट खोजकर्ताओं की पूंछ नस इंजेक्शन jugular कैथेटर इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प हो सकता है ।
प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम AngII अर्क है । पूंछ कफ रक्तचाप के आकलन के लिए पंप द्वारा AngII वितरण की प्रभावशीलता को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है । अर्क के 2 − 3 दिनों के बाद रक्तचाप में वृद्धि होनी चाहिए । सूजन है कि LysM+ कोशिकाओं सक्रियण, चीरा जहां पंप प्रत्यारोपित है के बजाय क्लिप के टांके के साथ किया जाना चाहिए बंद करने को प्रभावित कर सकता है सीमित करने के लिए । एक सीमा पूंछ नस इंजेक्शन के बारे में उल्लेख किया जाना चाहिए: सबसे अच्छा संभव डेटा अधिग्रहण करने के लिए, 4 वीडियो आमतौर पर प्रत्येक मन्या के लिए लिया जाता है. फ्लोरोसेंट संकेत कम हो जाती है, तो acridine ऑरेंज के ५० µ एल इंजेक्शन हैं, लेकिन पूंछ इंजेक्शन के साथ यह कई इंजेक्शन बनाने के लिए और खुर्दबीन उद्देश्य के तहत स्थिर मन्या रखने के लिए और अधिक मुश्किल है. jugular नस में एक कैथेटर की उपस्थिति की अवधि के बाद से यह प्लेटलेट में जमावट सक्रियण को प्रभावित कर रहा है प्रतिरक्षा कोशिकाओं सक्रियण मिलाना-अमीर प्लाज्मा तैयार 4 h कैथेटर आरोपण19के बाद । कैथेटर प्रत्यारोपण के इस पहलू आगे की जांच की जरूरत है ।
अंत में, यहां तक कि अगर हम AngII अर्क के बाद LysM+ सेल सक्रियकरण पर jugular कैथेटर आरोपण के प्रभाव की सराहना करते हैं, हम पूरी तरह से तैयारी की भूमिका का अनुमान नहीं कर सकते, त्वचा हटाने, और एक संभावित LysM पर मन्या अलगाव+ सेल सक्रियण. हम निष्कर्ष है कि LysMCre+IRG+ माउस की तरह प्रतिदीप्ति रिपोर्टर चूहों के उपयोग के लिए vivo इमेजिंग में पशु तैयारी के दौरान पोत अखंडता के विघटन से बचने की सिफारिश की है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जर्मन मिनिस्ट्री फॉर एजुकेशन ऐंड रिसर्च (BMBF 01EO1003 और BMBF 01EO1503) ने सपोर्ट किया था ।
Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
Braunol | B Braun | ||
Octeniderm | Schülke | ||
Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |