अलगाव और न्युट्रोफिल के लक्षण वर्णन-कार्यात्मक अध्ययन के लिए व्युत्पंन Microparticles
Summary
नए प्रोटोकॉल यहां वर्णित अलग और microparticles मानव और माउस न्यूट्रोफिल से व्युत्पंन की विशेषताएं हैं । इन प्रोटोकॉल ultracentrifugation, प्रवाह cytometry, और immunoblotting तकनीकों का उपयोग microparticle सामग्री का विश्लेषण करने के लिए, और वे सेलुलर समारोह में विभिंन प्रकार के सेल से व्युत्पंन microparticles की भूमिका का अध्ययन किया जा सकता है ।
Abstract
Polymorphonuclear न्युट्रोफिल-व्युत्पन्न microparticles (PMN)-एमपीएस) लिपिड bilayer, गोलाकार microvesicles से लेकर आकार 50 – 1000 एनएम व्यास में हैं । सांसद सेल-टू-सेल कम्युनिकेशन और सिग्नलिंग मशीनरी का एक नया विकसित, महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । क्योंकि उनके आकार और उनकी रिहाई की प्रकृति, हाल ही में जब तक सांसद अस्तित्व की अनदेखी की गई थी । हालांकि, बेहतर प्रौद्योगिकी और विश्लेषणात्मक तरीकों के साथ स्वास्थ्य और रोग में उनके समारोह अब उभर रहा है । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉलों को अलग-थलग और निस्र्पक PMN-सांसदों द्वारा फ्लो cytometry और immunoblotting के उद्देश्य से किया जाता है. इसके अलावा, कई कार्यांवयन उदाहरण दिए गए हैं । सांसद अलगाव के लिए इन प्रोटोकॉल तेजी से कर रहे हैं, कम लागत, और महंगी किट के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, वे अलगाव के बाद सांसदों के लेबल के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही पूर्व स्रोत कोशिकाओं के लेबल के लिए सांसद रिहाई से पहले, एक झिल्ली के प्रवाह cytometry द्वारा दृश्य और विश्लेषण के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर । इन तरीकों, तथापि, PMNs और सांसदों की शुद्धता और परिष्कृत विश्लेषणात्मक इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए की आवश्यकता सहित कई सीमाएं हैं । एक उच्च अंत प्रवाह cytometer के लिए मज़बूती से सांसदों का विश्लेषण और गलत सकारात्मक शोर या ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण पढ़ता को कम करने की जरूरत है । वर्णित प्रोटोकॉल अलग और सांसद उत्पत्ति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विभिन्न उत्तेजक स्थितियों के तहत संरचना में उनके मार्करों और भिन्नता की विशेषता. आकार विविधता की जांच करने के लिए शोषण किया जा सकता है कि झिल्ली कणों बनाम exosomes की सामग्री अलग है, और क्या वे ऊतक homeostasis में विभिंन भूमिकाओं को पूरा । अंत में, अलगाव और सांसदों के लक्षण वर्णन, सेलुलर प्रतिक्रियाओं और विभिंन रोग मॉडल (सहित, PMN-जुड़े भड़काऊ विकारों, जैसे भड़काऊ आंत्र रोग या तीव्र फेफड़ों की चोट) में उनके समारोह का पता लगाया जा सकता है ।
Introduction
हाल ही में, “microparticles/microvesicles” कोशिका cytosol या प्लाज्मा झिल्ली से उत्पंन महान वैज्ञानिक हित के बन गए हैं, के रूप में उभरते आंकड़ों का सुझाव है कि इन संरचनाओं, 50 से लेकर-व्यास में 1000 एनएम, जैविक जानकारी ले जा सकते है और सेलुलर संचार की एक गैर विहित विधि के रूप में सेवा करते हैं । प्रतिरक्षा सेल-प्राप्त सांसदों और विशेष रूप से polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (PMNs) द्वारा उत्पादित उन महान मेजबान रक्षा में PMNs की महत्वपूर्ण भूमिका दी रुचि के है1,2, भड़काऊ प्रतिक्रियाएं3, और घाव-हीलिंग 4. साज़िश, इस प्रकार अब तक, कई रिपोर्टों के दोनों समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ कार्य दिखाया है PMN-सांसदों5, एक संभावित संदर्भ का सुझाव है-, रोग, प्रजातियों, और अंग सांसदों की विशेष भूमिका ।
इस संचार में वर्णित प्रोटोकॉल एक लागत प्रभावी, अभिनव प्रदान करते हैं, और अनुकूलनीय विधि स्वास्थ्य और रोग में सांसदों के समारोह का अध्ययन करने के लिए । वे कई मॉडल जीवों के लिए लागू कर रहे हैं, अंगों, और उत्तेजना की स्थिति । वे सांसदों के कई प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देते है और उनके समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ कार्यों को संबोधित करने के लिए भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, यहां वर्णित है कैसे PMN के समारोह का अध्ययन करने के लिए- इन विट्रो में उपकला घाव हीलिंग में और vivo में। माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पंन PMNs के अलगाव के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पहले वर्णित विधि6से कुछ संशोधनों के साथ अनुकूलित किया गया था ।
इसके अलावा, इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल का पता लगाने और विशिष्ट मार्करों कि PMN पर पाया जा सकता है के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दो पूरक तरीकों से सांसदों: पश्चिमी दाग और प्रवाह cytometry । हम पाते है कि सांसदों के immunoblotting मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर5 आसान और विश्वसनीय है, तथापि, प्रवाह cytometry उपकरणों की संवेदनशीलता में हाल ही में अग्रिमों, और बेहतर शोर से संकेत अनुपात अब इस पद्धति का उपयोग कर सांसदों के आगे विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल हाल के अग्रिम और सिफारिशों को शामिल मूल अनुसंधान लेख से, केंद्रापसारक गति और समय को संशोधनों सहित, नमूना फ़िल्टरिंग और ठंड के अलावा/ , 8, और कैसे “पृष्ठभूमि शोर” को कम करने के लिए, PMN-सांसदों की पता लगाने की सीमा में सुधार, और सांसदों के विभिंन आकारों के बीच भेदभाव ।
Protocol
Representative Results
Discussion
PMN-व्युत्पंन सांसदों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल इस संचार में वर्णित हैं । कई महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए प्रक्रिया की सफलता के लिए । सबसे पहले, PMNs ताजा अलग किय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ सुचित्रा स्वामीनाथन की तकनीकी सहायता के लिए आभारी है जो उत्तर पश्चिमी Feinberg स्कूल ऑफ मेडिसिन फ्लो Cytometry कोर चलाता है । फंडिंग (NIH) DK101675 द्वारा प्रदान की गई ।
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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