Isolering og karakterisering af neutrofile-afledte mikropartikler for funktionelle studier
Summary
Nye protokoller er beskrevet her til at isolere og karakterisere mikropartikler stammer fra menneskelige og mus neutrofiler. Disse protokoller udnytte ultracentrifugering, flowcytometri og immunoblotting teknikker til at analysere microparticle indhold, og de kan bruges til at studere rollen af mikropartikler afledt af forskellige celletyper i cellefunktion.
Abstract
Polymorfnukleære neutrofile-afledte mikropartikler (PMN)-MPs) er lipid tolagede, sfærisk microvesicles med størrelser spænder fra 50-1.000 nm i diameter. MPs er et nyligt udvikling, vigtig del af celle-til-celle kommunikation og signalering maskiner. På grund af deres størrelse og arten af deres frigivelse, indtil for nylig blev MP eksistens overset. Dog med forbedret teknologi og analysemetoder er deres funktion i sundhed og sygdom nu fremstår. Protokollerne præsenteres her er rettet mod isolerer og karakteriserer PMN-MPs ved flowcytometri og immunoblotting. Derudover gives flere gennemførelsen eksempler. Disse protokoller for MP isolation er hurtig, billig, og kræver ikke brug af dyre kits. Desuden, de giver mulighed for mærkning af MPs efter isoleret, samt præ mærkning af datakildens celler før MP udgivelse, ved hjælp af en membran-specifikke fluorescerende farvestof til visualisering og analyse ved flowcytometri. Disse metoder, men har flere begrænsninger herunder renheden af PMNs og MPs og behovet for sofistikeret analytiske instrumentation. En high-end flow Flowcytometret er nødvendig for at pålideligt analysere MPs og minimere falske positive læser på grund af støj eller auto-fluorescens. De beskrevne protokoller kan bruges til at isolere og definere MP Biogenese og karakterisere deres markører og variation i sammensætning på forskellige stimulerende betingelser. Størrelse heterogenitet kan udnyttes til at undersøge, om indholdet af membran partikler versus exosomes er forskellige, og hvorvidt de opfylder forskellige roller i væv homøostase. Endelig, følgende isolering og karakterisering af parlamentsmedlemmer, deres funktion i cellulære svar og forskellige sygdomsmodeller (herunder, PMN-associerede inflammatoriske lidelser, såsom inflammatoriske tarmsygdomme eller akut lunge skade) kan udforskes.
Introduction
For nylig, “mikropartikler/microvesicles” stammer fra celle cytosol eller plasma membran er blevet af stor videnskabelig interesse, da nye data tyder på, at disse strukturer, spænder fra 50-1.000 nm i diameter, kan bære biologiske oplysninger og tjene som en ikke-kanoniske metode til cellulære kommunikation. Immun celle-afledte parlamentsmedlemmer og især dem, der produceres af polymorfkernede neutrofile (PMNs) er af stor interesse på grund af PMNs vigtige rolle i vært forsvar1,2, inflammatoriske respons3og sårheling 4. intriguingly, hidtil, talrige rapporter har vist både pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske funktioner PMN-MPs5, tyder på en potentiel kontekst – sygdom-, arter- og orgel-specifikke rolle af MPs.
Beskrevet protokoller i denne meddelelse giver en omkostningseffektiv, innovative og fleksibel metode til at studere funktionen af parlamentsmedlemmer i sundhed og sygdom. De er gældende for mange modelorganismer, organer og stimulation betingelser. De giver mulighed for identifikation af flere typer af MPs og kan bruges i fremtiden til at adressere deres pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske funktioner. Som et eksempel, beskrevet her er hvordan at studere funktionen af PMN-parlamentsmedlemmer i epitelial sår healing in vitro- og in vivo. Den præsenterede protokol til isolation af musen knoglemarv-afledte PMNs blev tilpasset med applikationsprogrammerne fra en tidligere beskrevne metode6.
Derudover protokoller er beskrevet i denne undersøgelse giver mulighed for påvisning og karakterisering af specifikke markører, der kan findes på PMN-MPs af to komplementære metoder: Western blot og flow flowcytometri. Vi finder, at immunoblotting af MPs bruger standardprotokoller5 er nem og pålidelig, men de seneste fremskridt i følsomhed flow flowcytometri instrumenter og forbedret støj til signal forholdet nu tillade til videre analyse af MPs ved hjælp af denne metode. Protokollerne beskrevet i denne undersøgelse inddrage de seneste fremskridt og anbefalinger fra originale forskningsartikler, herunder ændringer til centrifugering hastighed og tid, tilsætning af prøven filtrering og frysning/opbevaring betingelser7 , 8, og hvordan man kan reducere “baggrundsstøj”, forbedre detektionsgraensen for PMN-MPs og diskriminere mellem forskellige størrelser af MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoller til isolering og karakterisering af PMN-afledte hovedplan er beskrevet i denne meddelelse. Flere vigtige kritiske punkter skal tages hensyn til succes af proceduren. Første PMNs isoleret friske og anvendes i eksperimenter inden for 2 h af isolation til at forhindre spontan aktivering og degranulering. Alle håndtering af PMNs under isolation og op til punktet af stimulation skal udføres på isen for at forhindre aktivisering og tidlig MP release12. Andet ultracentrifugering i 1 time …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for den tekniske bistand fra Dr. Suchitra Swaminathan der kører det nordvestlige Feinberg School af medicin Flow flowcytometri kerne. Finansieringen blev leveret af (NIH) DK101675.
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
