Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles
Summary
Nouveaux protocoles sont décrits ici pour isoler et caractériser les microparticules dérivées de l’homme et les neutrophiles de souris. Ces protocoles utilisent l’ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblotting techniques pour analyser le contenu au moyen de microparticules, et ils peuvent être utilisés pour étudier le rôle de microparticules dérivés de divers types de cellules à fonction cellulaire.
Abstract
Polynucléaires neutrophiles dérivés microparticules (PMN)-MPs) sont bicouche lipidique, microvésicules sphérique avec des tailles allant de 50 à 1 000 nm de diamètre. MPs sont un nouvellement en évolution, une partie importante de la cellule-cellule communication et signalisation machines. En raison de leur taille et la nature de leur libération, existence de MP a été négligé jusqu’à récemment. Cependant, avec une technologie améliorée et des méthodes d’analyse leur rôle dans la santé et la maladie se dessine maintenant. Les protocoles présentés ici visent à isoler et à caractériser les PMN-MPs par immunotransfert et cytométrie en flux. En outre, plusieurs exemples d’application sont donnés. Ces protocoles d’isolement de MP sont rapides, peu coûteux et ne nécessitent pas l’utilisation de kits coûteux. En outre, ils permettent l’étiquetage des députés après isolement, mais aussi de marquage préalable des cellules source avant la sortie de MP, à l’aide d’un colorant fluorescent membranaires spécifiques pour la visualisation et l’analyse par cytométrie en flux. Ces méthodes, cependant, ont plusieurs limitations, y compris la pureté de l’APF et de députés et de la nécessité d’instruments d’analyse sophistiqués. Un cytomètre en flux haut de gamme il faut analyser MPs et de minimiser les fausses lectures positives en raison de bruit ou auto-fluorescence de façon fiable. Les protocoles décrits peuvent servir à isoler et à définir la biogenèse des MP et caractérisent leurs marqueurs et la variation dans la composition sous différentes conditions stimulantes. Hétérogénéité de taille peut être exploitée pour étudier la question de savoir si le contenu de particules de membrane versus exosomes est différent, et si elles jouent des rôles différents dans l’homéostasie tissulaire. Enfin, isolement et caractérisation des députés, leur rôle dans les réponses cellulaires et divers modèles de maladies (y compris, PMN associée à des troubles inflammatoires, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou la lésion pulmonaire aiguë) suivantes peuvent être explorées.
Introduction
Récemment, « microparticules/microvésicules » provenant du cytosol cellulaire ou de la membrane plasmique sont devenus de grand intérêt scientifique, comme de nouvelles données suggèrent que ces structures, allant de 50-1 000 nm de diamètre, peuvent transporter des données biologiques et servir de méthode de communication cellulaire non canonique. Immunitaire cellules dérivées MPs et particulièrement celles produites par les polynucléaires neutrophiles (PMN) sont d’un grand intérêt, étant donné l’importance de l’APF dans hôte défense1,2, réactions inflammatoires3et cicatrisation 4. Curieusement, jusqu’ici, de nombreux rapports ont montré des fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires du PMN-MPs5, suggérant un éventuel contexte – maladie-, espèce- et organe-spécifiques au rôle des députés.
Les protocoles décrits dans la présente communication fournissent une méthode rentable, innovante et adaptable pour étudier la fonction des députés dans la santé et la maladie. Elles s’appliquent à de nombreux organismes modèles, les organes et les conditions de stimulation. Elles permettent d’identifier plusieurs types de MPs et peuvent être utilisés à l’avenir pour traiter leurs fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Par exemple, décrit ici est de savoir comment étudier la fonction des PMN-MPs dans la plaie épithéliales guérison in vitro et in vivo. Le protocole présenté pour l’isolement de souris APF de moelle osseuse a été adapté avec quelques modifications d’une méthode décrite précédemment6.
En outre, les protocoles décrits dans cette étude permettent pour la détection et la caractérisation de marqueurs spécifiques que l’on retrouve sur PMN-MPs par deux méthodes complémentaires : Western blot et cytométrie en flux. Nous trouvons qu’immunoblotting de députés à l’aide de protocoles standard5 est simple et fiable, cependant, les progrès récents dans la sensibilité des instruments de cytométrie en flux et amélioration du rapport signal-bruit autorisent désormais une analyse plus approfondie des députés en utilisant cette méthode. Les protocoles décrits dans la présente étude incorporent les progrès récents et recommandations émanant des articles de recherche originaux, y compris les modifications apportées à la vitesse de centrifugation et de temps, l’ajout de l’échantillon des conditions de filtrage et surgélation/conservation7 , 8et comment réduire le « bruit de fond », améliorer la limite de détection de PMN-MPs et distinguer les différentes tailles de MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocoles d’isolement et caractérisation de dérivés de PMN MPs sont décrites dans la présente communication. Plusieurs points clés de la critique doit être tenus compte pour la réussite de la procédure. Tout d’abord, PMN doit être isolé frais et utilisé dans des expériences après 2 h d’isolement pour éviter la dégranulation et une activation spontanée. Toute manipulation des APF lors de l’isolation et jusqu’au moment de la stimulation doit être effectuée sur la glace pour prévenir l’activ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique du Dr Suchitra Swaminathan qui dirige le noyau Northwestern Feinberg School de médecine Flow Cytometry. Financé par la DK101675 (NIH).
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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