Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali
Summary
Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall’essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.
Abstract
Microparticelle neutrofili polimorfonucleate (PMN)-MPs) sono il doppio strato lipidico, microvescicole sferica con dimensioni che vanno da 50 – 1.000 nm di diametro. M/s sono una nuova evoluzione, parte importante della comunicazione cellula-cellula e segnalazione macchine. A causa della loro dimensione e la natura del loro rilascio, fino a poco tempo esistenza MP è stato trascurato. Tuttavia, con la migliore tecnologia e metodi analitici sta emergendo la loro funzione nella salute e nella malattia. I protocolli qui presentati mirano a isolare e caratterizzare PMN-MPs di immunoblotting e citometria a flusso. Inoltre, diversi esempi di implementazione sono dati. Questi protocolli per l’isolamento di MP sono veloci, basso costo e non richiedono l’uso di costosi Kit. Inoltre, essi consentono l’etichettatura di MPs dopo isolamento, così come pre-etichettatura delle cellule di origine prima del rilascio di MP, utilizzando un colorante fluorescente di membrana specifici per la visualizzazione e l’analisi di citometria a flusso. Questi metodi, tuttavia, hanno diverse limitazioni tra cui purezza di PMNs e MPs e la necessità di sofisticata strumentazione analitica. Un citometro a flusso High-end è necessario analizzare MPs e minimizzare letture false positive a causa di rumore o auto-fluorescenza in modo affidabile. I protocolli descritti possono essere utilizzati per isolare e definire la biogenesi di MP e caratterizzano i loro marcatori e variazione nella composizione sotto diverse condizioni stimolanti. Eterogeneità di dimensioni può essere sfruttata per indagare se il contenuto di particelle della membrana contro esosomi è diverso, e se essi soddisfano diversi ruoli nell’omeostasi del tessuto. Infine, può essere esplorate seguente isolamento e caratterizzazione di MPs, la loro funzione in risposte cellulari e vari modelli di malattia (tra cui, PMN-collegata di disordini infiammatori, quali le malattie infiammatorie intestinali o ferita acuta del polmone).
Introduction
Recentemente, “microparticelle/microvescicole” provenienti dal cytosol delle cellule o della membrana plasmatica sono diventati di grande interesse scientifico, come i dati emergenti suggeriscono che queste strutture, che vanno da 50-1.000 nm di diametro, possono trasportare informazioni biologiche e servire come un metodo non-canonica di comunicazione cellulare. Immunitario cellule derivate MPs e specialmente quelli prodotti dai neutrofili polimorfonucleari (PMNs) sono di grande interesse, dato l’importante ruolo di PMNs in host defense1,2, le risposte infiammatorie3e guarigione 4. intrigante, finora, numerose segnalazioni hanno dimostrato sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori funzioni di PMN-MPs5, suggerendo un potenziale contesto – malattia-, specie- e ruolo di organo-specific di MPs.
Protocolli descritti nella presente comunicazione forniscono un metodo conveniente, innovativo e adattabile per studiare la funzione di MPs nella salute e nella malattia. Sono applicabili a molti organismi modello, organi e condizioni di stimolazione. Essi consentono l’identificazione di diversi tipi di MPs e può essere utilizzati in futuro per affrontare le loro funzioni pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Ad esempio, descritto qui è come studiare la funzione di PMN-MPs in arrotolata epiteliale guarigione in vitro e in vivo. Il protocollo presentato per l’isolamento del mouse PMNs derivate da midollo osseo è stato adattato con alcune modifiche da un metodo descritto in precedenza6.
Inoltre, protocolli descritti in questo studio consentono l’individuazione e la caratterizzazione di marcatori specifici che possono essere trovati su PMN-MPs con due metodi complementari: Western blot e citometria a flusso. Troviamo che immunoblotting di MPs utilizzando protocolli standard5 è semplice e affidabile, tuttavia, i recenti progressi nella sensibilità di flusso cytometry strumenti e una migliore rapporto segnale-rumore ora consentono per ulteriori analisi di MPs utilizzando questo metodo. Incorporano i protocolli descritti in questo studio gli avanzamenti recenti e consigli da articoli di ricerca originale, incluse le modifiche alla velocità di centrifugazione e ora, l’aggiunta dell’esempio filtraggio e congelamento/conservazione condizioni7 , 8e come ridurre il “rumore di fondo”, migliorare il limite di rilevamento di PMN-MPs e discriminare tra diverse dimensioni di MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocolli per l’isolamento e la caratterizzazione di PMN-derivato MPs sono descritti nella presente comunicazione. Parecchi punti critici chiave deve tener conto per il successo della procedura. In primo luogo, PMNs deve essere isolato fresco e usato negli esperimenti entro 2 h di isolamento per prevenire degranulazione e attivazione spontanea. Tutte le gestione di PMNs durante l’isolamento e fino al punto di stimolazione deve essere eseguita sul ghiaccio per impedire l’attivazione e prematuro MP versione<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per l’assistenza tecnica del Dr. Suchitra Swaminathan che gestisce il nucleo di Northwestern Feinberg School di medicina citometria a flusso. Finanziamento è stato fornito da DK101675 (NIH).
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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