절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구
Summary
새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.
Abstract
Polymorphonuclear neutrophil 파생 미 (PMN)-MPs)는 지질 bilayer, 직경에서 50-1000 nm에서 배열 하는 크기와 구형 microvesicles. MPs는 새로 진화, 셀 통신 및 신호 기계의 중요 한 부분 이다. 그들의 크기와 그들의 자료의 성격, 때문에 최근까지 MP 존재 간과 했다. 그러나, 향상 된 기술 및 분석 방법으로 건강과 질병에 그들의 기능 지금 나오고 있다. 여기에 제시 된 프로토콜 겨냥 된다 격리 및 PMN MPs cytometry immunoblotting 여. 또한, 몇 가지 구현 예는 주어진 다. MP 격리에 대 한 이러한 프로토콜 빠르고, 낮은-비용, 고 비싼 키트를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 또한, 그들은 MPs 미리 MP 릴리스 이전 소스 셀 라벨 뿐 아니라 다음 격리, cytometry에 의해 시각화 및 분석을 위한 막 특정 형광 성 염료를 사용 하 여 라벨에 대 한 허용. 그러나 이러한 메서드는, PMNs MPs 및 정교한 분석 계측에 대 한 필요성의 순도 포함 하는 몇 가지 제한이 있다. 고급 흐름 cytometer 안정적으로 MPs를 분석 하 고 잡음 또는 자동 형광 거짓 긍정적인 읽기 최소화 필요 합니다. 설명된 프로토콜 격리 하 고 MP 속 정의 사용할 수 있습니다 그리고 그들의 마커 및 다른 자극 조건 하에서 구성 변화를 특징. 크기가 exosomes 대 막 입자의 내용 인지, 그리고 그들은 조직의 항상성에서 다른 역할을 수행할 여부를 조사 하기 위해 악용 될 수 있습니다. 마지막으로, 다음 격리 및 MPs, 세포질 응답에 있는 그들의 기능 및 다양 한 질병 모델 (등, PMN 관련 된 염증 성 질환, 염증 성 장 질환 등 심각한 폐 상해)의 특성화를 탐험 수 있습니다.
Introduction
최근, “미/microvesicles” 셀 cytosol 또는 원형질 막에서 발생 되 큰 과학적 관심의 신흥 데이터 직경에서 50-1000 nm에서까지 이러한 구조 생물학 정보를 전달 수 있습니다 제안 및 셀룰러 통신의 비 정식 방법으로 제공 합니다. 면역 세포 유래 MPs 및 특히 polymorphonuclear 호 중구 (PMNs)를 제작한 이들은 PMNs 호스트 방어1,2,3선 동적인 응답 및 상처 치유에 중요 한 역할을 주어 큰 관심의 4. 글, 지금까지 수많은 보고 보여주었다 PMN 의원5, 제안 하는 잠재적인 맥락, 질병-, 종 및 MPs의 기관 특정 역할의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능.
이 통신에 설명 된 프로토콜 건강과 질병에서 MPs의 기능을 연구, 혁신, 비용 효율적이 고 융통성 있는 방법을 제공 합니다. 그들은 많은 모형 유기 체, 기관, 및 자극 조건에 적용 됩니다. 그들은 MPs의 여러 종류의 식별을 위해 허용 하 고 그들의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능을 해결 하기 위해 나중에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 설명 여기에 상피 상처 치유 생체 외에서 vivoPMN MPs의 기능을 공부 하는 방법. 마우스 골 수 파생 PMNs는 앞에서 설명한 방법6에서 일부 수정 적응 했다의 격리에 대 한 제시 프로토콜.
또한,이 연구에서 설명 하는 프로토콜 탐지 및 PMN MPs에 두 개의 상호 보완적인 방법으로 찾을 수 있는 특정 표시의 특성화에 대 한 허용: 서쪽 오 점 그리고 cytometry 흐름. 그러나 우리는 표준 프로토콜5 를 사용 하 여 MPs의 immunoblotting 간단 하 고 신뢰할 수 있는,, 감도 교류 cytometry 악기, 그리고 향상 된 잡음 대 신호 비율의 최근 발전 지금 허용 MPs의 추가 분석을 위해이 방법을 사용 하 여 찾을. 이 연구에서 설명된 프로토콜 통합 최근 발전과 수정 원심 분리 속도 시간, 샘플 필터링 및 동결/스토리지 조건7 의 추가 포함 하 여 원래 연구 기사에서 추천 , 8, 그리고 “배경 잡음”을 줄일, PMN MPs의 검출 한계를 개선 하 고 MPs의 다른 크기를 구분 하는 방법.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 통신 프로토콜 격리 및 PMN 파생 된 MPs의 특성화에 대 한 설명 합니다. 몇 가지 중요 한 요점 절차의 성공에 대 한 계정에 촬영 해야 합니다. 첫째, PMNs 신선한 격리 하 고 자발적인 활성화와 degranulation 방지 하기 위해 절연의 2 h 이내 실험에 사용 될 해야 합니다. 격리 하는 동안 및 자극의 지점 PMNs의 모든 처리 활성화와 조기 MP 릴리스12방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 합니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 북서부 Feinberg 학교의 의학 교류 Cytometry 코어를 실행 하는 박사 Suchitra Swaminathan의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 자금 (NIH) DK101675에 의해 제공 했다.
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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