Isolering og karakterisering av nøytrofile-avledet Microparticles for funksjonell studier
Summary
Nye protokoller er beskrevet her for å isolere og karakterisere microparticles avledet fra menneskelige og mus nøytrofile. Disse protokollene benytte ultracentrifugation, flowcytometri og immunoblotting-teknikker for å analysere microparticle innhold, og de kan brukes til å studere rollen til microparticles fra ulike celletyper i cellulære funksjoner.
Abstract
Polymorfonukleære nøytrofile-avledet microparticles (PMN)-MPs) er lipid bilayer, sfærisk microvesicles med størrelser fra 50 – 1000 nm i diameter. MPs er en ny utvikling, viktig del av celle-til-celle kommunikasjon og signalnettverk maskiner. På grunn av sin størrelse og natur deres utgivelse, inntil nylig ble MP eksistens oversett. Men med forbedret teknologi og analytiske metoder fremstår funksjoner i helse og sykdom nå. Protokollene som presenteres her er rettet mot isolere og karakterisere PMN-MPs av flowcytometri og immunoblotting. Dessuten er flere implementering eksempler gitt. Disse protokollene MP isolering er rask, rimelig, og krever ikke bruk av dyre kits. Videre tillate de merkingen av MPs etter isolasjon, samt pre merking av kildecellene før MP utgivelsen med en membran-spesifikke fluorescerende farge for visualisering og analyse av flowcytometri. Disse metodene, har imidlertid flere begrensninger inkludert renhet av PMNs og MPs og behovet for avansert analytisk instrumentering. En high-end flyt-cytometer er nødvendig å pålitelig analysere MPs og minimere falske positive leser på grunn av støy eller auto-fluorescens. Beskrevet protokollene kan brukes til å isolere og definere MP biogenesis og karakterisere deres markører og variasjon i komposisjon under ulike stimulerende forhold. Størrelse heterogenitet kan utnyttes for å undersøke om innholdet av membran partikler versus exosomes er forskjellige, og om de oppfyller ulike roller i vev homeostase. Til slutt, følgende isolering og karakterisering av MPs, funksjoner i mobilnettet svar og ulike sykdom modeller (inkludert, PMN-assosiert inflammatoriske lidelser, som inflammatorisk tarm sykdommer eller akutt lungen skade) kan utforskes.
Introduction
Nylig, “microparticles/microvesicles” som stammer fra cellen stoffer eller plasma membranen har blitt av stor vitenskapelig interesse, som nye data tyder på at disse strukturene, fra 50-1000 nm i diameter, kan bære biologiske informasjon og tjene som en ikke-kanoniske metode for mobil kommunikasjon. Immun celle-avledet MPs og spesielt de som produseres av polymorfonukleære nøytrofile (PMNs) er av stor interesse gitt PMNs viktig rollen som vert forsvar1,2, inflammatorisk svar3og sårhelende 4. intriguingly, hittil, mange rapporter har vist både pro-inflammatoriske og anti-inflammatorisk funksjoner PMN-MPs5, antyder en potensiell sammenheng, sykdom, arter- og organ-spesifikke rollen MPs.
Beskrevet protokoller i denne kommunikasjonen gir en kostnadseffektiv, nyskapende og praktisk metode for å studere funksjonen MPS i helse og sykdom. De gjelder for mange modell organismer, organer og stimulering betingelser. De tillater identifikasjon av flere typer MPs og kan brukes i fremtiden å ta deres pro-inflammatoriske og anti-inflammatorisk funksjoner. Som et eksempel, beskrevet slik studere funksjonen PMN-MPS i epithelial sår helbredelse i vitro og i vivo. Presentert protokollen for isolering av musen Ben margtransplantasjon-avledet PMNs ble tilpasset noen endringer fra en tidligere beskrevet metode6.
Videre beskrevet i denne studien-protokoller brukes av karakteristikk av spesifikke indikatorer som kan bli funnet på PMN-MPs av to utfyllende metoder: Western blot og flow cytometri. Vi finner at immunoblotting MPS bruker standard protokoller5 er enkel og pålitelig, men nylige fremskritt innen følsomhet flyt cytometri instrumenter og forbedret støy til signal ratio nå tillater for videre analyse av MPs benytter denne metoden. Beskrevet protokollene i denne studien innlemme siste fremskritt og anbefalinger fra opprinnelige forskningsartikler, inkludert modifikasjoner på sentrifugering fart og tid, tillegg av prøven filtrering og frysing/lagring forhold7 , 8og hvordan redusere “bakgrunnsstøy”, forbedre gjenkjenning grensen PMN-MPS og skille mellom forskjellige størrelser av MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoller for isolering og karakterisering av PMN-avledet MPs er beskrevet i denne kommunikasjonen. Flere viktige kritiske punkter må tas i betraktning for suksessen til prosedyren. PMNs må først isolert frisk og brukes i eksperimenter innen 2 t isolasjon for å hindre spontan aktivisering og omfatter degranulering. Alle håndtering av PMNs under isolasjon og opp til punktet av stimulering må utføres på is for å hindre aktivering og tidlig MP utgivelsen12. Andre, ultracentrifugation 1 h e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for teknisk assistanse av Dr. Suchitra Swaminathan som driver nordvest Feinberg skolen av medisin Flow cytometri kjernen. Midler ble gitt av (NIH) DK101675.
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
