Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales
Summary
Aquí se describen nuevos protocolos para aislar y caracterizar micropartículas derivadas de humano y ratón neutrófilos. Estos protocolos utilizan técnicas immunoblotting para analizar contenido de micropartículas, ultracentrifugación y citometría de flujo, y pueden ser utilizados para estudiar el papel de micropartículas derivadas de diversos tipos celulares en función de las células.
Abstract
Micropartículas de derivados de neutrófilos polimorfonucleares (PMN)-MPs) son bicapa lipídica, microvesículas esféricas con tamaños que van desde 50-1.000 nm de diámetro. MPs son una nueva evolución, parte importante de comunicación célula a célula y la maquinaria de señalización. Debido a su tamaño y la naturaleza de su liberación, hasta hace poco existencia de MP fue pasado por alto. Sin embargo, con la mejor tecnología y métodos analíticos su función en la salud y la enfermedad ahora está emergiendo. Los protocolos aquí presentados están dirigidos a aislar y caracterizar PMN-MPs por immunoblotting y citometría de flujo. Por otra parte, se dan varios ejemplos de aplicación. Estos protocolos para el aislamiento de MP son rápidos y de bajo costo y no requieren el uso de equipos costosos. Además, permiten el etiquetado de diputados tras aislamiento, así como el etiquetado de células de origen antes de la liberación de MP, con un colorante fluorescente de membrana específicos para visualización y análisis por citometría de flujo. Estos métodos, sin embargo, tienen varias limitaciones, incluyendo la pureza de PMNs y parlamentarios y la necesidad de instrumentación analítica sofisticada. Un citómetro de flujo gama alta es necesario para analizar MPs y minimizar falsos positivo Lee debido a ruido o auto fluorescencia fiable. Los protocolos descritos pueden utilizarse para aislar y definir la biogénesis MP y caracterizan a sus marcadores y variación en la composición en diferentes condiciones de estimulación. Heterogeneidad de tamaño puede ser explotado para investigar si el contenido de partículas de membrana versus exosomas es diferente, y si cumplen diferentes funciones en la homeostasis del tejido. Por último, pueden explorarse la siguientes aislamiento y caracterización de MPs, su función en respuestas celulares y varios modelos de enfermedad (incluyendo, trastornos inflamatorios asociados de PMN, como enfermedades inflamatorias del intestino o la lesión pulmonar aguda).
Introduction
Recientemente, se han convertido en de gran interés científico, “micropartículas/microvesículas” origina en el citosol celular o membrana plasmática como datos emergentes sugieren que estas estructuras, que van desde 50-1.000 nm de diámetro, pueden llevar información biológica y servir como un método no-canónico de la comunicación celular. Inmune celula derivados de MPs y particularmente los producidos por los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) son de gran interés dado el importante papel de PMNs en host defense1,2,3de las respuestas inflamatorias y cicatrización 4. sorprendentemente, hasta ahora, numerosos informes han demostrado funciones pro inflamatorias y antiinflamatorias de PMN-MPs5, sugiriendo un potencial contexto, enfermedad, especies-y papel de órgano-específica de MPs.
Los protocolos descritos en esta comunicación proporcionan un método rentable, innovadora y adaptable para estudiar la función del MPs en salud y enfermedad. Son aplicables a muchos organismos modelo, órganos y las condiciones de estimulación. Permiten la identificación de varios tipos de MPs y puede utilizarse en el futuro para atender sus funciones pro inflamatorias y antiinflamatorias. Por ejemplo, describe cómo estudiar la función de PMN-MPs en epitelial de la herida curativa en vitro y en vivo. El protocolo presentado para el aislamiento de ratón PMNs de médula ósea fue adaptado con modificaciones de un método previamente descrito6.
Además, protocolos descritos en este estudio permiten la detección y caracterización de marcadores específicos que se pueden encontrar en PMN-MPs por dos métodos complementarios: Western blot y citometría de flujo. Encontramos que el immunoblotting de MPs mediante protocolos estándar5 es fácil y confiable, sin embargo, recientes avances en la sensibilidad de los instrumentos de la citometría de flujo y mejor relación señal de ruido ahora permiten más análisis de MPs usando este método. Los protocolos descritos en este estudio incorporan avances recientes y las recomendaciones de artículos originales de investigación, incluyendo modificaciones en la velocidad de centrifugación y tiempo, la adición de muestra de filtrado y almacenamiento de congelación condiciones7 , 8y cómo reducir el “ruido de fondo”, mejorar el límite de detección de PMN-MPs y discriminar entre diferentes tamaños de MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocolos para el aislamiento y caracterización de derivados de PMN MPs se describen en la presente comunicación. Varios puntos críticos claves deben tenerse en cuenta para el éxito del procedimiento. En primer lugar, PMNs deben aislados fresco y utilizadas en experimentos de dentro de 2 h de aislamiento para evitar la degranulación y la activación espontánea. Toda la gestión de PMNs durante el aislamiento y hasta el punto de estimulación se debe realizar en hielo para evitar la activación y prematuro MP relea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por la asistencia técnica de Dr. Suchitra Swaminathan que dirige el núcleo de Northwestern Feinberg escuela de medicina citometría de flujo. La financiación fue proporcionada por DK101675 (NIH).
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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