Isolering och karakterisering av neutrofiler-derived mikropartiklar för funktionella studier
Summary
Nya protokoll beskrivs här för att isolera och karakterisera mikropartiklar som härrör från människa och mus neutrofiler. Dessa protokoll utnyttja ultracentrifugering och flödescytometri immunoblotting tekniker för att analysera microparticle innehåll och de kan användas för att studera rollen av mikropartiklar som härrör från olika celltyper i cellulär funktion.
Abstract
Polymorfonukleära neutrofiler-derived mikropartiklar (PMN)-MPs) är lipid lipidens, sfäriska microvesicles med storlekar från 50-1000 nm i diameter. MPs är en nyligen utvecklas, en viktig del av cell-till-cell kommunikation och signalering maskiner. På grund av deras storlek och arten av deras frigivning, tills nyligen förbisågs MP existens. Dock med förbättrad teknik och analysmetoder deras funktion vid hälsa och sjukdom nu växer fram. De protokoll som presenteras här är att isolera och karakterisera PMN-MPs av flödescytometri och immunoblotting. Dessutom ges flera genomförandet exempel. Dessa protokoll för MP isolering är snabba, Billiga och kräver inte användning av dyra kit. Dessutom möjliggör de märkning av MPs efter isolering, samt före märkning av källcellerna före MP utgåvan, med ett membran-specifika fluorescerande färgämne för visualisering och analys av flödescytometri. Dessa metoder, men har flera begränsningar inklusive renhet PMNs och MPs och behovet av sofistikerade analysinstrument. En high-end flödescytometer behövs för att tillförlitligt analysera MPs och minimera falska positiva läsningar på grund av buller eller auto-fluorescens. Protokoll som beskrivs kan användas för att isolera och definiera MP biogenes och karakterisera deras markörer och variation i sammansättningen under olika stimulerande förhållanden. Storlek heterogenitet kan utnyttjas för att undersöka om innehållet i membran partiklar kontra exosomes är olika, och huruvida de uppfyller olika roller i vävnad homeostas. Slutligen kan följande isolering och karakterisering av MPs, deras funktion i cellulära svar och olika sjukdomsmodeller (inklusive, PMN-associerade inflammatoriska sjukdomar, såsom inflammatoriska tarmsjukdomar eller Akut lungskada) utforskas.
Introduction
Nyligen, ”mikropartiklar/microvesicles” med ursprung från cell cytosol eller plasmamembranet har blivit av stort vetenskapligt intresse, eftersom nya data tyder på att dessa strukturer, alltifrån 50-1000 nm i diameter, kan bära biologisk information och fungera som en icke-kanoniska metod för cellulär kommunikation. Immun cell-derived MPs och särskilt sådana som produceras av polymorfonukleära neutrofiler (PMNs) är av stort intresse med tanke på den viktiga rollen som PMNs i värd försvar1,2, inflammatoriskt svar3och sårläkning 4. spännande, hittills, talrika rapporter har visat både proinflammatoriska och antiinflammatoriska funktioner PMN-MPs5, vilket tyder på en potentiell kontext – sjukdom-, arter- och organ-specifika roll av MPs.
Beskrivna protokollen i detta meddelande ger en kostnadseffektiv, anpassningsbart och innovativ metod för att studera funktionen av MPs i hälsa och sjukdom. De är tillämpliga på många modellorganismer, organ och stimulering villkor. De möjliggör identifiering av flera typer av MPs och kan användas i framtiden att ta itu med deras proinflammatoriska och antiinflammatoriska funktioner. Som exempel beskrivs här är hur man studera funktionen av PMN-MPs i epitelial sår läka in vitro- och in vivo. Det presenteras protokollet för isolering av mus benmärg-derived PMNs anpassades med några ändringar från en tidigare beskrivna metod6.
Dessutom protokoll som beskrivs i denna studie kan för upptäckt och karakterisering av specifika markörer som kan hittas på PMN-MPs av två kompletterande metoder: Western blot och flödescytometri. Vi tycker att immunoblotting av MPs använder standardprotokoll5 är enkelt och pålitligt, dock senaste framsteg i känslighet flöde flödescytometri instrument, och förbättrat buller-till-signal-förhållande nu tillåter, för vidare analys av MPs med denna metod. Protokoll som beskrivs i denna studie införliva senaste framstegen och rekommendationer från ursprungliga forskningsartiklar, inklusive ändringar av centrifugeringsvarvtal och tid, tillägg av prov filtrering och frysning/lagring villkor7 , 8och hur man minska ”bakgrundsljud”, förbättra detektionsgränsen för PMN-MPs och diskriminera mellan olika storlekar av MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoll för isolering och karakterisering av PMN-derived MPs beskrivs i detta meddelande. Flera viktiga kritiska punkter måste beaktas för att lyckas med förfarandet. Först måste PMNs vara isolerade färska och används i experiment inom 2 h isolering för att förhindra spontana aktivering och degranulering. All hantering av PMNs under isolering och fram till punkten av stimulering måste utföras på is för att förhindra aktivering och förtida MP release12. Andra, ultracentrifugering …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för tekniskt bistånd av Dr Suchitra Swaminathan som driver nordvästra Feinberg skola av medicin Flow flödescytometri kärnan. Finansieringen tillhandahölls av (NIH) DK101675.
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
