यहाँ हम कैसे एक अणु तस्वीर सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी एक जीवित Drosophila melanogaster तीसरे instar लार्वा के मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर किया जा सकता है वर्णन.
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक की बढ़ती संख्या तंत्र है कि नेनो सेलुलर दुनिया को नियंत्रित करने के लिए उजागर करने के लिए मदद कर रहे हैं । एकल अणु इमेजिंग गति प्राप्त करने के रूप में यह जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत अणुओं के दृश्य के लिए असाधारण उपयोग प्रदान करता है । यहाँ, हम Drosophila लार्वा में एकल-कण ट्रैकिंग फ़ोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (sptPALM) निष्पादित करने के लिए विकसित एक तकनीक का वर्णन करते हैं । Synaptic संचार कुंजी presynaptic प्रोटीन है कि डॉकिंग, भड़काना, और प्लाज्मा झिल्ली के साथ न्यूरोट्रांसमीटर युक्त बुलबुले के विलय को बढ़ावा देने के द्वारा कार्य पर निर्भर करता है । प्रोटीन की एक सीमा प्रोटीन और प्रोटीन लिपिड बातचीत कसकर इन प्रक्रियाओं और presynaptic प्रोटीन इसलिए इन प्रमुख घटनाओं में से प्रत्येक के साथ जुड़े गतिशीलता में परिवर्तन प्रदर्शित नियंत्रित करता है । इन प्रोटीन की गतिशीलता की जांच कैसे एक बरकरार रहते जानवर में उनके शारीरिक समारोह के साथ संबंधित है उनके कार्रवाई की सटीक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है । vivo में उच्च संकल्प के साथ प्रोटीन गतिशीलता निकालने जैसे ऑप्टिकल पारदर्शिता, पहुंच, और पैठ गहराई के रूप में सीमाओं पर काबू पाने की आवश्यकता है । हम वर्णन कैसे photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन presynaptic प्रोटीन Syntaxin के लिए टैग-1a थोड़ा टेढ़ा रोशनी के माध्यम से कल्पना की जा सकती है और मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर नज़र रखी है या मोटर के साथ ंयूरॉन तीसरे instar के axon Drosophila माथ.
ंयूरॉन संचार न्यूरोट्रांसमीटर जारी है, जो न्यूरोट्रांसमीटर के विनियमित संलयन के माध्यम से होता है पर निर्भर करता है-प्लाज्मा झिल्ली के साथ synaptic बुलबुले1युक्त. यह प्रक्रिया2exocytosis बुलाया,3,4,5,6 अत्यधिक गतिशील है और अप कर सकते है या नीचे-उत्तेजना7की दर में उतार चढ़ाव के अनुसार विनियमित । इन प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन Brownian गति के अधीन हैं, और इसलिए nanoscopic संगठन प्रदर्शन बाध्यकारी कार्यों की एक श्रृंखला है कि इन शारीरिक कार्यों underpin बनाए रखने में सक्षम है । प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन अत्यधिक गतिशील, प्लाज्मा झिल्ली पर nanoclusters में अणुओं के पार्श्व फँसाने की अनुमति है7,8,9,10,11, 12. जैसे, इन प्रोटीन की गतिशीलता की जांच की कार्रवाई के अपने मोड स्पष्ट करने में मदद करता है8। Synaptic प्रोटीन जैसे घुलनशील N-ethylmaleimide संवेदनशील कारक लगाव प्रोटीन रिसेप्टर्स (जाल), उदाहरण के लिए Syntaxin-1a, अब पार्श्व तेजी से गतिशीलता प्रदर्शित करने के लिए जाना जाता है, साथ ही साथ nanoclusters के भीतर फंसाना पार्श्व फँसाना है कि आणविक के रूप में सेवा कर सकते हैं डिपो और पुटिका फ्यूजन9,13,14,15के लिए साइटें ।
इस तरह के monomeric (एम) Eos16,17 और Kaede18के रूप में photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन, के हाल के विकास के दृष्टिकोण के उपयोग के माध्यम से ंयूरॉन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के nanoscopic संकल्प की अनुमति दी है ऐसे फोटो के रूप में सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान)14,15,19. इन घटनाओं की गतिशीलता और nanoclustering में जैविक प्रोटीन के प्रसंस्कृत रहते कोशिकाओं और ंयूरॉंस में जांच सक्षम है । हाल ही में, अध्ययन किया गया है स्पष्ट करने के लिए (इसी तरह उच्च प्रस्तावों पर) की गतिशीलता और संगठन इन झिल्ली प्रोटीन के न्यूरॉन्स में रहते बरकरार जीवों के ऐसे मस musculus, Caenorhabditis एलिगेंस, और Drosophila melanogaster14,20,21,22.
vivo में एक प्रोटीन की गतिशीलता और संगठन की जांच (जैसे पाम, स्टॉर्म, और photoconvertible fluorophores) के रूप में हाल ही में विकसित सुपर संकल्प इमेजिंग उपकरणों के न केवल उपयोग की आवश्यकता है, लेकिन यह भी बाधा को दूर करने की क्षमता ऐसे के रूप में प्रोटीन की पहुंच और इमेजिंग लेजर के प्रवेश गहराई । इमेजिंग एक बरकरार पशु में intracellular प्रोटीन स्वाभाविक रूप से चुनौतीपूर्ण है संरचनाओं पर इमेजिंग प्रोटीन बरकरार पशुओं के जीवित ऊतकों के भीतर गहरी एंबेडेड है, ऐसे एक बरकरार माउस के हिप्पोकैंपस के रूप में । इसलिए, प्रोटीन पर या ऊतक की सतह के करीब अधिक आसानी से imaged हैं । vivo में इमेजिंग के साथ एक और कठिनाई जानवरों के पार reproducibility सुनिश्चित करने में है । के रूप में शरीर रचना विज्ञान एक नमूना से दूसरे के लिए अलग हो सकता है, अलग बरकरार पशु नमूनों में पुनरावृत्ति की आसानी के साथ एक संरचना का चयन भी चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है । ऐसे synapses के रूप में टकसाली संरचनाओं के उपयोग, इन कठिनाइयों में से कुछ पर काबू पाने के साथ मदद ।
हाल के अध्ययनों से इस तरह के Caenorhabditis एलिगेंसके रूप में एक ऑप्टिकली पारदर्शी एपिडर्मिस के साथ पशुओं में प्रोटीन गतिशीलता imaged है, जबकि अंय जांचों एक ऊतक की सतह पर छवि प्रोटीन संगठन/ actin एक जीवित माउस की खोपड़ी के माध्यम से cortical न्यूरॉन्स में इमेजिंग21. कुछ मामलों में, पशु निश्चेतक रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, विशिष्ट निश्चेतक प्रतिकूल ब्याज की प्रोटीन को प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक का अर्थ है vivo इमेजिंग में के दौरान पशुओं के मोबाइल रखने के लिए इसलिए त्रुटि को कम करने के लिए पता लगाया जाना चाहिए ।
vivo में सुपर संकल्प इमेजिंग करने के लिए एक और चेतावनी है कि लेजर के लिए ब्याज की प्रोटीन को उजागर इस्तेमाल प्रतिकूल आसपास के ऊतकों को प्रभावित कर सकता है, और इसलिए कम के रूप में संभव के रूप में उत्तेजना तीव्रता रखने की सिफारिश की है । लेजर द्वारा आसपास के ऊतकों की रोशनी भी पृष्ठभूमि संकेत को बढ़ाने के लिए जाता है । कम उत्तेजना तीव्रता के उपयोग में मदद करता है पृष्ठभूमि को कम करने, चेतावनी जा रहा है यह भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन फोटॉन उपज में कमी के लिए नेतृत्व कर सकता है । विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि घटाव छवि विश्लेषण करने से पहले पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए एक वैकल्पिक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Drosophila vivo इमेजिंग में के लिए एक आदर्श जीव प्रस्तुत के रूप में यह विशिष्ट प्रोटीन समारोह की जांच के लिए अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक उपकरण प्रदान करता है । ऊपर अनुक्रम सक्रिय (यूएएस)-Gal4 प्रणाली प्रोटीन के लौकिक और स्थानिक अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है और इसलिए neurotransmission में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है23, इस तरह के कि थर्मामीटरों आनुवंशिक उत्तेजना Drosophila क्षणिक का उपयोग कर रिसेप्टर संभावित उप परिवार A1 (dTRPA1)24 या ऑप्टो-आनुवंशिक दूर लाल स्थानांतरित CsChrimson25 इमेजिंग14के साथ जोड़ा जा सकता है का उपयोग कर उत्तेजना । हम इस प्रणाली में vivo एकल-अणु इमेजिंग में प्रदर्शन की जटिलताओं के कई दूर है और अब का वर्णन कैसे एकल कण ट्रैकिंग Drosophila melanogaster तीसरे instar लार्वा में किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एकल-अणु mEos2 की ट्रैकिंग-टैग प्रोटीन के neuromuscular जंक्शन पर Drosophila तृतीय instar लार्वा । ट्रांसजेनिक प्रोटीन की अधिक से अधिक अभिव्यक्ति से बचने के लिए, Syntaxin-1a-mEos2 अभिव्यक्ति अंतर्जात Syntaxin-1a प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था । synaptic प्रोटीन गतिशीलता के अध्ययन ज्यादातर इन विट्रो में सीमित किया गया है प्रसंस्कृत कोशिकाओं और cortical न्यूरॉन्स के9,11,12,13. क्या इन प्रोटीन एक जीवित जानवर में इसी तरह की गतिशीलता हस्ताक्षर प्रदर्शन काफी हद तक अज्ञात है । vivo मेंएकल प्रोटीन गतिशीलता कल्पना करने के लिए, ऑप्टिकल पारदर्शिता, पहुंच, और पैठ गहराई जैसे सीमाओं को दूर किया जाना है । लार्वा तैयार करने और मांसपेशी की सतह पर एंबेडेड neuromuscular जंक्शनों visualizing द्वारा, हम ऑप्टिकल पारदर्शिता और पहुंच के मुद्दे से बचें । सामांय TIRF विंयास में छवि एकल अणु गतिशीलता के प्रयास असफल साबित हुआ । हालांकि, थोड़ा परोक्ष रोशनी का उपयोग बढ़ा उत्तेजना लेजर मर्मज्ञ गहराई के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, लार्वा को स्थिर करने के लिए प्रयुक्त minutien पिन प्रोटीन गतिशीलता पर संवेदनाहारी उपयोग के किसी भी संभावित प्रतिकूल प्रभाव से बचने में मदद करता है । यह 100x तेल विसर्जन उद्देश्यों के रूप में उच्च आवर्धन उद्देश्यों, का उपयोग करने के लिए संभव है, vivo मेंएकल अणुओं कल्पना । हालांकि, वृद्धि हुई इज़ाफ़ा ध्यान से बाहर बहाव की हो सकती है । इसके अलावा, हम एक कम तीव्रता का इस्तेमाल किया है (~ 30%) ५६१ एनएम लेजर सफलतापूर्वक मोटर तंत्रिका टर्मिनलों पर छवि एकल अणुओं के लिए । अतिरिक्त परीक्षण के लिए कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है ।
इस प्रोटोकॉल synaptic प्रोटीन की गतिशीलता को न्यूरॉन प्लाज्मा झिल्ली की निकटता के भीतर कल्पना करने के लिए उपयुक्त है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, जाल प्रोटीन की गतिशीलता-Syntaxin-1a और autophagosome बाउंड प्रोटीन Atg18a-सफलतापूर्वक vivo14,26 मेंimaged किया गया है । मोटर न्यूरॉन axons पर प्रोटीन की गतिशीलता की भी जांच की जा सकती है27. हालांकि, मस्तिष्क या ventral तंत्रिका गर्भनाल पर प्रोटीन की गतिशीलता की जांच के लिए अंतर्निहित ऊतक द्वारा उत्पादित उच्च पृष्ठभूमि संकेत के कारण का आकलन करने के लिए मुश्किल साबित हो सकता है; इसके अलावा, एक ही मस्तिष्क संरचना पर प्रोटीन गतिशीलता visualizing फ्लोरोसेंट मस्तिष्क संरचना टैगिंग की आवश्यकता होगी (replicability सुनिश्चित करने के लिए), और दोहरे कैमरा इमेजिंग के उपयोग की जरूरत होगी ।
वर्तमान Drosophila में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए उपलब्ध तरीकों ज्यादातर इमेजिंग भ्रूण को सीमित कर रहे हैं, बजाय अधिक विकसित तीसरे instar लार्वा३८,३९। इन प्रोटोकॉल के साथ मुख्य मुद्दा यह है कि वे imaged क्षेत्र में पथ की एक कम संख्या में उपज है, और इसलिए गतिशीलता राज्यों की गहराई से विश्लेषण को रोकने के22,४०। हमारे vivo एकल अणु ट्रैकिंग प्रोटोकॉल में पथ की एक उच्च संख्या उत्पंन करने की क्षमता है, और इसलिए Caenorhabiditis एलिगेंस और zebrafish जैसे अंय पशु मॉडलों में इस्तेमाल किया जा सकता है । दरअसल, हर NMJ श्रृंखला उत्पंन ~ २,४०० यह अलग मोबाइल राज्यों और इन राज्यों के बीच संक्रमण14,27का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त बनाने पथ । इसके अतिरिक्त, vivo एकल अणु इमेजिंग रणनीतियों में कई जानवरों को20,22, जो शारीरिक समारोह के तहत इमेजिंग किया जाता है बदल सकता है स्थिर करने के लिए निश्चेतक के उपयोग पर भरोसा करते हैं । यहाँ हम minutien पिन का उपयोग लार्वा स्थिर करने के लिए एक ‘ संज्ञाहरण मुक्त ‘ प्रोटोकॉल अनुकूलित.
इस प्रोटोकॉल का एक संभावित उपयोग तीन आयामों में प्रोटीन की गतिशीलता visualizing के लिए हो सकता है । सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में हाल ही में प्रगति प्रोटीन गतिशीलता में ‘ एक्स ‘, ‘ y ‘, और ‘ जेड आयाम४१,४२में इन विट्रो में visualized किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं । हमारे वर्तमान पद्धति ‘ जेड ‘ धुरी में प्रोटीन की गतिशीलता के लिए खाते में नहीं है । अभी तक Drosophila मोटर तंत्रिका टर्मिनल एक गोलाकार संरचना और एक मूल्यवान भविष्य के दृष्टिकोण के लिए एक तीन आयामी मात्रा४३में प्रोटीन गतिशीलता बढ़ाता होगा । z में इमेजिंग-आयाम एक astigmatic लेंस का उपयोग कर व्यवहार्य है । वैकल्पिक रूप से, TIRF मोड में४४,४५, z-समाधान भी बढ़ जाती है । हालांकि, हमारे प्रयोगों में, हम astigmatic लेंस के बिना syntaxin1A-mEos2 के एकल अणुओं कल्पना करने के लिए थोड़ा टेढ़ा रोशनी का इस्तेमाल किया है ।
अंत में, दोनों एक ट्रांसजेनिक Drosophila मक्खी शेयर व्यक्त प्रोटीन एक photoconvertible प्रोटीन के साथ टैग की उपलब्धता, टुकड़े लार्वा ट्रांसजेनिक करने के लिए एक PDMS आधार, साथ ही साथ एक TIRF माइक्रोस्कोप बदलने की संभावना से सुसज्जित रोशनी के कोण सबसे महत्वपूर्ण इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एकल प्रोटीन कल्पना उपकरण की जरूरत है ।
The authors have nothing to disclose.
हम एकल-अणु विश्लेषण के साथ अपनी तरह के समर्थन के लिए जीन बपतिस्मा देनेवाला Sibarita और डैनियल Choquet (IINS, CNRS/बोर्डो के विश्वविद्यालय) धंयवाद । हम विशेष रूप से निक Valmas और जेसिका Mcgaw (QBI, क्वींसलैंड के विश्वविद्यालय) वीडियो रिकॉर्डिंग, आवाज के साथ उनकी मदद के लिए धंयवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चित्र ग्राफिक डिजाइन । यह काम ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (एआर) डिस्कवरी प्रोजेक्ट (DP170100125 to F.A.M.), ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (राहत ग्रांट LE0882864 टू F.A.M.), फ्यूचर फेलोशिप (FT100100725 टू B.V.S.), ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (राहत ग्रांट) द्वारा समर्थित किया गया था । LE130100078 को F.A.M.) और NHMRC परियोजना अनुदान (APP1103923 to B.V.S.) । F.A.M. एक NHMRC सीनियर रिसर्च फेलो (ONT1060075) हैं ।
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |