Her vi illustrere hvordan ett molekyl Foto-aktivert lokalisering mikroskopi kan utføres på motor nerve terminalen til en live Drosophila melanogaster tredje skikkelsen larve.
Et økende antall super-oppløsning mikroskopi teknikker hjelper for å avdekke mekanismene som styrer nanoskala mobilnettet verden. Single-molekylet imaging frammarsj som det gir eksepsjonell tilgang til visualisering av molekyler i levende celler. Her beskriver vi en teknikk som vi utviklet for å utføre single-partikkel sporing Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (sptPALM) i Drosophila larver. Synaptiske kommunikasjon er avhengig av nøkkel presynaptic proteiner som fungerer docking, grunning og fremme blanding av nevrotransmitter inneholder blemmer med plasma membranen. En rekke protein-protein og protein-lipid interaksjoner regulerer tett disse prosessene og presynaptic proteiner derfor utstilling endringer i mobilitet tilknyttet hver av disse viktige hendelser. Undersøker hvordan mobilitet av disse proteinene korrelerer med fysiologiske funksjoner i en intakt levende dyr er nødvendig for å forstå deres nøyaktige virkningsmekanismen. Utdrager protein mobilitet med høy oppløsning i vivo krever overvinne begrensninger som optisk oversikt, tilgjengelighet og gjennomtrenging dyp. Beskriver vi hvordan photoconvertible fluorescerende proteiner merket med presynaptic protein Syntaxin-1A kan visualisere via liten skrå belysning og spores på motor nerve terminal eller langs motoriske nervecellen axon av tredje skikkelsen Drosophila larve.
Neuronal kommunikasjon er avhengig av nevrotransmitter utgivelse, som oppstår gjennom regulert blanding av nevrotransmitter inneholder synaptic blemmer med plasma membranen1. Denne prosessen kalles exocytosis2,3,4,5,6 kan er svært dynamisk og opp – eller ned-regulert ifølge svingninger i prisen av stimulering7. Proteiner involvert i disse prosessene kan Brownsk bevegelse, og derfor vise nanoscopic organisasjonen kan opprettholde en rekke bindende handlinger som understøtter disse fysiologiske funksjoner. Plasma membran proteiner er svært dynamisk, slik at lateral fangst av molekylene i nanoclusters plasma membranen7,8,9,10,11, 12. Slik bidrar undersøker mobilitet av disse proteinene til å belyse modusen for handling8. Synaptiske proteiner som løselig N-ethylmaleimide følsom faktor vedlegg protein receptors (snarer), for eksempel Syntaxin-1A, er nå kjent som viser lateral rask mobilitet, samt lateral overlapping i nanoclusters som kan tjene som molekylær depoter og nettsteder for vesicle, fusion,9,,13,,14,,15.
Den siste utviklingen av photoconvertible fluorescerende proteiner, som monomerisk (m) Eos16,17 og Kaede18, har tillatt nanoscopic oppløsning neuronal plasma membran proteiner ved hjelp av tilnærminger slik Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) og Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)14,15,19. Denne utviklingen har aktivert etterforskning mobilitet og nanoclustering av biologiske proteiner i kulturperler lever celler og neurons. Nylig har studier vært gjennomført for å belyse (på lignende høy oppløsning) dynamikk og organiseringen av disse membran proteiner i nervecellene i live intakt organismer slik Mus musculus, Caenorhabditis elegans, og Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Undersøker dynamikk og organisering av et protein i vivo krever ikke bare bruker de nylig utviklet super-oppløsning bildebehandling verktøyene (som PALM, STORM og photoconvertible fluorophores), men også evnen til å overvinne hindringer slik som tilgjengelighet av protein og gjennomtrenging dybden av tenkelig laser. Bildebehandling intracellulær proteiner i et intakt dyr er iboende utfordrende som er bildebehandling proteiner på strukturer dypt i levende vev av intakt dyret, som hippocampus en intakt mus. Derfor er proteiner på eller nær overflaten av vev lettere fotografert. En annen vanskelighet med imaging i vivo er å sikre reproduserbarhet over dyrene. Som anatomi kan variere fra ett utvalg til den andre, kan velge en struktur med enkel replikering i forskjellige intakt dyr prøver også være utfordrende. Bruk av stereotype strukturer, som synapser, hjelpe å overvinne noen av disse vanskelighetene.
Nyere studier har fotografert protein mobilitet i dyr med en optisk gjennomsiktig overhuden som Caenorhabditis elegans22, mens andre undersøkelser har fotografert organisasjon, protein på overflaten av en vev/orgel, for eksempel utgangen imaging i kortikale nevroner gjennom skallen fra en levende mus21. I noen tilfeller har bedøvelse blitt brukt til å holde dyr immobile; Imidlertid kan bestemte bedøvelse påvirke protein av interesse. Alternative måter å holde dyr immobile under i vivo imaging bør derfor utforskes for å redusere feil.
En annen påminnelse til super-oppløsning tenkelig i vivo er at lasere brukes til å belyse proteiner rundt kan påvirke de omkringliggende vev, og dermed holde eksitasjon intensiteten så lavt som mulig anbefales. Belysning av de omkringliggende vev av laser også en tendens til å øke bakgrunnen signalet. Bruk av lav eksitasjon intensitet bidrar til å redusere bakgrunnen, innvendingen blir det kan også føre til en nedgang i fluorescerende protein Foton avkastning. Bakgrunn subtraksjon under analyse kan brukes som et alternativ betyr å redusere bakgrunnen signalet før bildeanalyser.
Drosophila presenterer en ideell organisme for i vivo tenkelig som gir veletablerte genetisk verktøy for etterforskningen av bestemt protein-funksjonen. Oppstrøms aktivering sekvensen (UAS)-Gal4 gir timelige og romlig uttrykk av proteiner og kan derfor brukes til å manipulere neurotransmission23, slik at thermo-genetiske stimulering bruke Drosophila forbigående reseptor potensielle sub familie A1 (dTRPA1)24 eller opto-genetiske stimulering bruke far-red-skiftet CsChrimson25 kan kombineres med bildebehandling14. Vi har overvunnet mange av komplikasjoner til å utføre i vivo single-molekylet bildebehandling i dette systemet og nå beskrive hvordan single-partikkel sporing kan utføres i Drosophila melanogaster tredje skikkelsen larver.
Denne protokollen beskriver single-molekylet sporing av mEos2-merket proteiner i Drosophila tredje skikkelsen Larven nevromuskulær krysset. For å unngå over-uttrykk av transgene protein, ble Syntaxin-1A-mEos2 uttrykket drevet av endogene Syntaxin-1A arrangøren. Studier av synaptic protein mobilitet er stort sett begrenset til i vitro undersøkelser av kultivert celler og kortikale nevroner9,11,12,13. Om disse proteinene viser lignende mobilitet signaturer i levende dyr er hovedsakelig ubekjent. For å visualisere single-protein mobilitet i vivo, har begrensninger som optisk oversikt, tilgjengelighet og gjennomtrenging dyp overvinnes. Ved å dissekere larver utarbeidelse og visualisere de nevromuskulære knutepunktene på overflaten av muskelen, unngå vi spørsmålet om optisk åpenhet og tilgjengelighet. Forsøk til bildet én-molekylet mobilitet i normale TIRF konfigurasjonen virket. Men gir bruk av litt skrå belysning økt eksitasjon laser gjennomtrengende dybde. Videre minutien pinnene til nakkens Larven hjalp for å unngå ethvert mulig virkning anestesi bruk på protein mobilitet. Det er mulig å bruke høyere forstørrelse mål, for eksempel 100 x olje nedsenking mål, for å visualisere enkelt molekyler i vivo. Økt forstørrelse kan imidlertid øke forekomst av driver ute av fokus. I tillegg har vi brukt en lavere intensitet (~ 30%) 561 nm laser vellykket til bildet én molekyler på motor nerve terminaler. Ytterligere testing kan være nødvendig å bruke lavere laser makt.
Denne protokollen er egnet til å visualisere mobilitet i synaptic proteiner i nærheten av neuronal plasma membranen. Bruker denne tilnærmingen, mobiliteten av SNARE protein – Syntaxin-1A og autophagosome bundet protein Atg18a – har vært vellykket fotografert i vivo14,26. Mobilitet av proteiner på motor neuron axons kan også være undersøkt27. Men kan undersøkelse av mobilitet av proteiner i hjernen eller ventrale være vanskelig å vurdere på grunn av høye signalet produsert av underliggende vev; i tillegg visualisere protein mobilitet på samme hjernen strukturen vil kreve fluorescently merking hjernen strukturen (for å sikre replicability), og bruk av dual-kamera bildebehandling ville være nødvendig.
Gjeldende metoder tilgjengelig for super-oppløsning mikroskopi i Drosophila er stort sett begrenset til tenkelig embryoer, snarere enn mer utviklet tredje skikkelsen Larven38,39. Hovedproblemet med disse protokollene er at de gir et lavt antall baner i området fotografert, og dermed hindre dybdeanalyse mobilitet stater22,40. Våre i vivo ett molekyl sporing protokollen har kapasitet til å generere et stort antall baner, og kan derfor brukes i andre dyr modeller som Caenorhabiditis elegans og sebrafisk. Faktisk generert hver NMJ kjeden ~ 2400 baner slik at det passer for å analysere ulike mobile tilstander og overganger mellom stater14,27. I tillegg er mange i vivo ett molekyl tenkelig strategier avhengig av bruk av bedøvelse å nakkens av dyr20,22, som kan endre fysiologiske funksjon som avbilding er gjort. Her optimalisert vi en “anestesi-gratis” protokollen å nakkens Larvene bruker minutien pinner.
En potensiell bruk av denne protokollen kan være for å visualisere mobilitet av proteiner i tre dimensjoner. Nylige fremskritt innen super-oppløsning mikroskopi tillate protein mobilitet visualisert i vitro i ‘x’, ‘y’, og ‘z’ dimensjoner41,42. Vår nåværende metoden høyde ikke for mobilitet av proteiner i ‘z’ aksen. Likevel Drosophila motor nerve terminal er en sfærisk struktur og en verdifull fremtidige tilnærming vil være å kvantifisere protein mobilitet i en tredimensjonal volum43. Imaging i z-dimensjonen er mulig med en astigmatic linse. Alternativt i TIRF modus44,45, er z-oppløsningen også økt. Men i vårt forsøk, har vi brukt litt skrå belysning for å visualisere enkelt molekyler av syntaxin1A-mEos2 uten astigmatic linsen.
I konklusjonen, tilgjengeligheten av både en transgene Drosophila fly lager uttrykke proteiner merket med en photoconvertible protein, en PDMS base å dissekere transgene Larven, samt TIRF mikroskop utstyrt for å endre den vinkel på belysning er viktigste verktøy for å visualisere enkelt proteiner som beskrevet i denne protokollen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jean-Baptiste Sibarita og Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universitetet i Bordeaux) for vennlig støtte med enkelt-molekylet analyse. Vi takke spesielt Nick Valmas og Jessica Mcgaw (QBI, Universitetet i Queensland) for deres hjelp med video innspillingen, voice-over, samt finne grafisk design. Dette arbeidet ble støttet av australske Research Council (AR) oppdagelsen prosjektet (DP170100125 F.A.M.), den australske forskningsråd (LIEF Grant LE0882864 F.A.M.), fremtiden fellesskap (FT100100725 til B.V.S.), australske forskningsråd (LIEF Grant LE130100078 til F.A.M.) og NHMRC prosjektstøtte (APP1103923 til B.V.S.). F.A.M. er NHMRC seniorstipendiat (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |