胚胎干细胞的跨内细胞质量注射导致嵌合体率增高
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以增加嵌合体生产不使用新设备。一个简单的方向改变的胚胎注射可以增加胚胎的数量, 并有可能缩短时间的生殖传播。
Abstract
为了通过 ES 细胞方法提高转基因小鼠的效率, 我们提出了一种对目前囊胚注射协议的适应。在这里, 我们报告, 胚胎的简单旋转, 并通过跨内细胞质量 (TICM) 的注射增加了嵌合体小鼠的百分比从31% 到 50%, 没有额外的设备或进一步的专门训练。在9月内注射了26种不同的近交无性系克隆和35株总无性系。传统注射技术与 TICM 的妊娠率、胚胎恢复率均无显著性差异。因此, 如果没有任何重大改变的注射过程和简单的定位胚泡和注射通过 ICM, 释放 ES 细胞进入囊胚腔可以有可能提高嵌合生产的数量和随后生殖传输。
Introduction
近25年来, 基因靶向小鼠的产生一直是一个缓慢的过程, 经常受到胚胎干细胞微注射阶段的瓶颈的阻碍, 生殖传送合体的产生。最近的进展, 包括 CRISPR/Cas91、2针对 ES 细胞和高吞吐量 es 细胞生成联盟 (如 KOMP), 改善了基因改良 ES 细胞的生成/可用性。然而, 生殖合体的产生仍然是从这些 ES 细胞中创建基因修饰小鼠的瓶颈3,4。高吞吐量 es 细胞生成项目受到 es 细胞质量高变异性的困扰, 这对于成功创建生殖合体至关重要。此外, 一些常用 ES 细胞系以高体检著称, 生殖主管合体5难以生产。
已经开发了许多方法来创建具有更高的嵌合体的老鼠, 或完全 ES 细胞衍生的老鼠6,7,8,9,10。虽然这些系统都有自己的优点, 但也有其缺点。生成的二、四倍体杂交合体, 同时生成 100% ES 细胞派生的小鼠, 是低效的, 通常限于 outbred线5, 6.新的注入桑椹胚的方法可以产生高百分比合体, 接近 100%, 但通常需要大量额外设备 (激光器或 piezos) 和训练 10, 11.在这些技术已经到位的实验室里, 可能没有必要采用这种新的方法。
本研究的目的是寻找一种利用常用技术和现成设备来提高嵌合体生成率的方法, 增加突变等位基因生殖传播的几率, 建立后续的小鼠群。
Protocol
Representative Results
Discussion
长期以来, 人们一直认为 ICM 的任何干扰都可能导致死亡率, 事实上, 目前的胚泡微注射协议仍然警告此12,13。我们在这里显示的是, 通过 ICM 的显微注射不损害胚胎, 并增加合体的产量。
这种效果的确切机制尚未确定。然而, ICM 的机械干扰, 以及伴随的 hypoblast, 应将 ES 细胞的发病率增加到新形成的 ICM 后, 显微注射。最近在 iPSCs 领域的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了 (部分) 的支持, 由美国国立卫生研究院 NIH 的内部研究计划。特别感谢 Shyamal Peddada 的统计分析。我们还要感谢汉弗瑞, 加里鸟, 和雪荒尾照片, 以审查这份手稿, 和佛朗哥 DeMayo 继续支持和建议。
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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